The Regulation of VEGF Signal Axis by DATS and the Improvement of Formation of Placental Angiogenesis in URSA Mice
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摘要:
目的 探讨二烯丙基三硫醚（diallyl trisulfide，DATS）对不明原因反复自然流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）小鼠胎盘血管生成的影响，并基于血管内皮细胞生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2 ，VEGFR-2）信号通路探索其作用机制。 方法 将16只URSA小鼠随机分为对照组与实验组，每组8只，实验组常规饲喂的同时给予纯度为98%的DATS，按照50 mg/（kg·d）配制成200 μL悬浊液进行灌胃；对照组常规饲喂的同时给予 200 μL PBS液灌胃。2组孕鼠连续给药18 d后，使用分光光度计检测胎盘组织中的硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）含量，使用反转录酶-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测胎盘组织中血小板-内皮细胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，CD31）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）与VEGFR2的 mRNA相对表达量，并使用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测胎盘组织中VEGFA与VEGFR2的蛋白表达水平。 结果 分光光度计检测结果显示：实验组（777.4922±72.9759） nmol/g H2S水平显著高于对照组（529.1824±99.7489） nmol/g （P < 0.05）；RT-qPCR结果显示：实验组CD31的相对表达量（0.0042±0.0006）显著高于对照组（0.0020±0.0004）（P < 0.05）、实验组VEGFA的相对表达量（0.7073±0.0677）显著高于对照组（0.5200±0.0946）（P < 0.05）、实验组VEGFR2的相对表达量（0.7304±0.1262）显著高于对照组（0.3984±0.047）（P < 0.05）；Western blot结果显示，DATS可显著提高胎盘组织中VEGFA和VEGFR2的蛋白表达水平（P < 0.05）。 结论 DATS可显著提高URSA胎盘组织中的H2S水平及胎盘组织中血管形成因子CD31、VEGFA及VEGFR2的相对表达量，并通过VEGF信号轴改善URSA小鼠胎盘血管的形成，将为DATS的临床应用提供一定的科学依据和参考价值。 Abstract:Objective The aim of this study is to investigate the effect of Diallyl trisulfide （DATS） on placental angiogenesis in mice with unexplained recurrent spontaneous abortion （URSA） and to explore its mechanism based on the vascular endothelial growth factor （VEGF）/vascular endothelial growth factor receptor-2 （VEGFR-2） signaling pathway. Methods Sixteen URSA mice selected were randomly divided into the control group and the experimental group, with 8 mice in each group. The experimental group was given 98% pure DATS （200 μL suspension prepared according to 50 mg/（kg·d) by gavage. The rats in the control group were fed conventionally and given 200 μL PBS solution by gavage. After 18 days of continuous administration, Hydrogen sulfide （H2S） content in the placental tissue was detected by spectrophotometer, and the relative expression of CD31, VEGFA and VEGFR2 mRNA in the placental tissue was detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The protein expression levels of VEGFA and VEGFR2 in placenta were detected by Western blot. Results The spectrophotometer detection showed that the H2S level in the experimental group （777.4922±72.9759） was significantly higher than that in the control group （529.1824±99.7489） （P < 0.05）; The RT-qPCR results showed that the relative expression of CD31 in the experimental group （0.0042±0.0006） was significantly higher than that in the control group （0.0020±0.0004） （P < 0.05）, the relative expression of VEGFA in the experimental group （0.7073±0.0677） was significantly higher than that in the control group （0.5200±0.0946）（P < 0.05）, and the relative expression of VEGFR2 in the experimental group （0.7304±0.1262） was significantly higher than that in the control group （0.3984±0.047） （P < 0.05）; Western blot results showed that DATS significantly increased the protein expression levels of VEGFA and VEGFR2 in placental tissue （P < 0.05）. Conclusion DATS can significantly increase the level of H2S in URSA placental tissue and the relative expression levels of angiogenic factors CD31, VEGFA, and VEGFR2 in placental tissue. Through the VEGF signal axis, it can improve the formation of placental blood vessels in URSA mice. The relevant research results will provide scientific basis and reference value for the clinical application of DATS. -
Key words:
- DATS /
- VEGF signaling axis /
- URSA mice /
- Placental vessels
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气管支气管结核（tracheobronchial tuberculosis，TBTB）是发生在气管支气管黏膜、黏膜下层平滑肌、软骨及外膜的结核病，是结核病的特殊临床类型[1]。近年来，我国TBTB的发病率随结核病发病率呈上升趋势，约有10%～40%的肺结核患者合并TBTB，且女性发病率约为男性的2倍[1]。常规抗结核治疗无法解决气道瘢痕狭窄、阻塞性肺不张等问题，纤维支气管介入技术可以弥补常规抗结核治疗的缺陷，使TBTB漏诊、误诊现象减少，尽可能地改善患者的肺功能，从而提高疗效[2]。在TBTB的气管镜介入治疗中，经支气管镜局部注药治疗、经支气管镜冷冻治疗、支气管镜下局部注药联合雾化3种方法有着举足轻重的地位。但是目前尚缺乏3种治疗方法优劣的循证证据。
1. 资料与方法
1.1 文献检索
采用主题词和自由词联合检索PubMed、Web of Science、EMBase、中国知网（CNKI）、 万方数据库（Wanfang）、维普数据库（VIP），通过搜索引擎进行补充检索。中文检索词为：“支气管结核”“气管支气管结核”“气管支气管内膜结核”“冷冻治疗”“冷冻疗法”“冷冻”“注药”“局部注药”“药物疗法”“药物灌注”“雾化”“随机对照”“随机”等。英文检索词为：“Tuberculosis”“Mycobacterium tuberculosis infection”“Cryotherapies”“Cold therapy”“Regional perfusion antineoplastic chemotherapy”“Regional perfusion”“Atomization”“Nebulization”“Randomized controlled trials”“RCT”。
1.2 纳入标准
本研究纳入国内外公开发表的临床随机对照试验（randomized controlled trial，RCT），无论是否使用盲法，语种限定为中文和英文，刊登日期为自各数据库建库起至2023年5月。本研究对象是临床上确诊为气管支气管结核（tracheobronchial tuberculosis，TBTB）[1]的患者，年龄、性别不限。
1.2.1 对照措施
对照组患者使用常规抗结核方案治疗，包括但不限于2HRZE/10HR、2HRZE/10HRE、3HRZE/9HRE、2HRZE/4HR、4HRZE/8HR等（H：异烟肼，R：利福平，Z：吡嗪酰胺，E：乙胺丁醇）。
1.2.2 干预措施
研究组患者在对照组基础上给予任何一种支气管镜下介入治疗。具体介入治疗类型包括：常规+局药、常规+冷冻、常规+局药+雾化等3种干预措施。
1.2.3 结局指标
本研究的结局指标包括：（1）临床症状治疗有效率；（2）纤维支气管镜下有效率；（3）治疗后不良反应发生率；（4）治疗后8周末痰菌转阴率；（5）治疗后24周末痰菌转阴率。临床症状疗效评定标准：（1）显效：咳嗽、咳痰及呼吸困难等症状完全消失；（2）有效：咳嗽、咳痰及呼吸困难等症状有明显改善。总有效率 = （显效例数+有效例数）/总例数×100%。镜下疗效分为以下标准：（1）显效：黏膜光滑或少许瘢痕形成，视野所见支气管的管腔无明显狭窄或轻度狭窄（即管腔 > 2/3原管腔直径）；（2）有效：黏膜轻度瘢痕挛缩，视野所见支气管管腔中度狭窄（即管腔 > 1/3原管腔直径）。总有效率 = （显效例数+有效例数）/总例数×100%。痰菌转阴率：连续3次抗酸杆菌涂片检查阴性认为已由阳性转为阴性，痰菌转阴率 = 阴性/总例数×100%。
1.3 排除标准
（1）非RCT研究、综述、会议论文等；（2）内容缺失的文献；（3）重复的文献；（4）干预措施不符或评价指标太少的文献。
1.4 文献质量评价
采用Cochrane偏倚风险评估工具对纳入的各项RCT进行评价，具体包括：选择偏倚、实施偏倚、测量偏倚、随访偏倚、报告偏倚、其他偏倚等6个方面[3]。
1.5 资料提取
由2名研究员从数据库中将文献导出至NoteExpress软件，并独立对文献进行筛选及交叉核对，如有分歧则寻求第3位研究者协助判断。筛选文献前先使用软件的查重功能将重复发表的文献排除，然后阅读文题和摘要进行初步筛选，剔除明显不符合要求的文献、综述、会议论文后，再阅读全文确定最终是否纳入。纳入研究的基本信息及基线特征包括：文献第一作者，发表时间，各组的样本数、患者的年龄、干预措施、结局指标等。
1.6 统计学处理
文献质量评价采用Review Manager 5.3完成，区间估计采用95%可信区间（CI）。网络关系图应用Stata 16.0软件绘制，当网络证据图有闭环的情况时需进行不一致性检验，本研究各干预措施间无闭合环产生，故无需进行不一致性检验。采用Stata 16.0绘制“比较-校正”倒漏斗图及累计概率排序图，用“比较-校正”倒漏斗图来检验研究间小样本效应及偏倚的存在。累计概率排序图则使用曲线下面积对各干预措施进行排序。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 文献检索结果
共检索到相关文献610篇，经过逐层筛选与排除，最终纳入38篇文献[4-41]，发表年份为2002年至2021年，共计3 114名患者，其中对照组1503例，实验组1611例。涉及4种干预措施，包括常规抗结核、常规联合支气管镜局部给药（27篇，试验组1119例，对照组1028例）、常规联合支气管镜冷冻治疗（9篇，试验组346例，对照组335例）、常规联合支气管镜局部给药联合雾化治疗（2篇，试验组146例，对照组140例）。其中，常规抗结核记为常规，常规联合支气管镜局部给药记为常规+局药，常规联合支气管镜冷冻治疗记为常规+冷冻，常规联合支气管镜局部给药联合雾化治疗记为常规+局药+雾化，文下表述同上。文献筛选流程见图1，纳入文献的基本特征见表1。
表 1 纳入研究基本信息[（$\bar x \pm s $ ）/n（%）]Table 1. Includes basic research information [（$\bar x \pm s $ ）/n（%）]文献来源 例数 年龄/岁 干预措施 结局指标 试验组/对照组 试验组/对照组 试验组/对照组 田江华2014[4] 31/31 35.6 ± 13.1/36.0 ± 13.0 常规+局药/常规2HRZE/10HR ①④ 高鸿2021[5] 45/45 46.63 ± 3.82/46.52 ± 3.74 常规+局药/常规2HRZE/10HRE ①③ 张新宝2015[6] 36/36 17～71 常规+局药/常规3HRZE/9HRE ①③④⑤ 张德利2019[7] 34/34 - 常规+局药/常规3HRZE/9HR ①④ 崔金霞2021[8] 40/40 36.75 ± 5.28/37.43 ± 5.56 常规+局药/常规2HRZE/10HR ①⑤ 符少平2009[9] 85/35 29 ± 1.12/31 ± 1.26 常规+局药/常规2HRZE/4HR ②④ 肖斌2020[10] 39/39 43.15 ± 1.35/43.62 ± 1.32 常规+局药/常规HRZE ①⑤ 潘丽2013[11] 34/33 37.85 ± 7.12/38.63 ± 7.34 常规+局药/常规2HRZE（S）/10HR ③⑤ 郑飞2013[12] 23/23 50 ± 11/49 ± 11 常规+局药/常规2HRZE（S）/6HRE ①② 刘宗道2002[13] 26/26 36.8 ± 11.2/37.1 ± 10.9 常规+局药/常规2HRZE/4HR ④⑤ 韩彩丽2013[14] 62/58 33.5 ± 6.7/32.8 ± 6.2 常规+局药/常规3HRZE（S）/9HRE ①② 叶涛生2018[15] 32/32 52.38 ± 13.71/52.35 ± 13.68 常规+局药/常规HRZELfx ①③④ 孙明华2017[16] 48/47 47.6 ± 3.8/48.2 ± 3.4 常规+局药/常规2HRZE/10HRE ①③ 陈廷宪2021[17] 41/41 28.75 ± 3.62/28.65 ± 3.59 常规+局药/常规2HRZE/10HRE ①③④ 胡翠兰2015[18] 38/37 37.4 ± 8.2/38.2 ± 8.7 常规+局药/常规2HRZS/4HR ①② 陈艳2009[19] 52/41 20～76 常规+局药/常规2HRZE（S）/10HR ④⑤ 王枝梅2012[20] 36/36 18～61 常规+局药/常规 ①③ 张胜堂2020[21] 48/46 35.81 ± 12.46/36.37 ± 13.15 常规+局药/常规2HRZS/10HRE ⑤ 朱红涛2020[22] 41/41 46.48 ± 12.34/47.03 ± 11.57 常规+局药/常规2HRZS/4HR ③ 杨新建2021[23] 30/30 43.30 ± 3.41/42.40 ± 2.11 常规+局药/常规2HRZE/4HR ①③⑤ 张含琼2016[24] 44/41 38.2 ± 10.1/42.9 ± 13.2 常规+局药/常规2HRZE/10HRE ③⑤ 张廷梅2008[25] 35/18 16～61/6～51 常规+局药/常规HRZE（S） ①④⑤ 刘斌远2012[26] 47/46 18～65/17～67 常规+局药/常规3HRZE/9HRE ①②④ 李史来2013[27] 34/34 18～61 常规+局药/常规2HRZE（S）/10HRE ①②④ 庄辉2019[28] 35/35 44.31 ± 8.69/43.63 ± 9.81 常规+局药/常规2HRZE/10HRE ⑤ 付娟2017[29] 73/73 - 常规+局药/常规4HRZE/8HR ①⑤ 程耀强2021[30] 30/30 48.96 ± 8.02/49.25 ± 9.42 常规+局药/常规HRZE ①③④ 如克亚木2020[31] 48/48 40.06 ± 3.66/39.65 ± 3.26 常规+冷冻/常规2HRZE/10HRE ①③ 刘荣奎2016[32] 51/50 46.58 ± 4.52/45.62 ± 4.48 常规+冷冻/常规2HRZE/10HR ①③ 蒋凛2019[33] 35/35 43.12 ± 4.03/42.36 ± 4.21 常规+冷冻/常规3HR ①③ 王志刚2019[34] 33/31 43.12 ± 16.82/44.03 ± 15.52 常规+冷冻/常规3HRZE/9HRE ①②③④⑤ 王莉2013[35] 39/31 30.52 ± 12.75 常规+冷冻/常规HRZE ②④ 姜心成2018[36] 30/30 47.5 ± 10.5/48.5 ± 11.5 常规+冷冻/常规HRE ①③⑤ 刘明2018[37] 34/34 31.29 ± 12.93/32.49 ± 12.87 常规+冷冻/常规 ② 于丹2016[38] 46/46 48.1 ± 4.3/47.5 ± 5.3 常规+冷冻/常规2HRZE/4HR ①③⑤ 黄自强2021[39] 30/30 45.20 ± 13.14/45.25 ± 12.56 常规+冷冻/常规2HRZE/10HRE ①③ 陆兰英2010[40] 116/112 18～71/16～70 常规+局药+雾化/常规2HRZE（S）/6HRE ①②③④ 谭红玉2014[41] 30/28 20～60/16～58 常规+局药+雾化/常规 ①④⑤ 注：H：异烟肼；R：利福平；Z：吡嗪酰胺；E：乙胺丁醇；S：链霉素；Lfx：左氧氟沙星，全文其他地方同。①：临床症状治疗有效率；②：纤维支气管镜下有效率；③：治疗后不良反应发生率；④：治疗后8周末痰菌转阴率；⑤：治疗后24周末痰菌转阴率。 2.2 纳入文献的质量评价
所有研究均为RCT[4-41]。有26项研究具体说明了随机序列及分配过程的产生[4，9-31，33，37]，所有研究均未提及对受试者和研究者以及结局设盲，均完整报告了申明的变量以及数据资料。大部分研究不清楚是否存在其他偏倚，见图2。
2.3 Meta分析
2.3.1 临床症状治疗有效率
28项研究[4-8，10，12，14-18，20，23，25-27，29-34，36，38-41]报道了临床症状治疗有效率，网状Meta分析网络共涉及4种干预措施，分别为常规、常规+局药、常规+冷冻、常规+局药+雾化（下同），证据关系详见图3A（图中，每个圆圈代表一种干预措施，圆圈面积越大代表应用该种干预措施进行治疗的患者越多；两圆圈之间的线段代表两种干预措施间进行直接比较，线段越粗说明两种干预措施之间直接比较的例数越多，若没有线段连接说明两种干预措施之间没有进行直接比较）。
图 3 证据关系图A：临床症状有效率纳入研究证据关系；B：纤维支气管镜下有效率纳入研究证据关系；C：治疗后8周末痰菌转阴率纳入研究证据关系；D：治疗后24周末痰菌转阴率纳入研究证据关系；E：治疗后不良反应发生率纳入研究证据关系。Figure 3. Evidence diagram网状 Meta分析结果表明，与常规疗法比较，常规+冷冻[OR = 5.90，95%CI（3.13，11.10），P < 0.05]、常规+局药[OR = 6.20，95%CI（4.53，8.49），P < 0.05]、常规+局药+雾化[OR = 14.32，95%CI（5.42，37.85），P < 0.05]均可显著提高临床症状有效率，差异具有统计学意义（P < 0.05）。但是常规+冷冻、常规+局药、常规+局药+雾化之间两两相互比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），见表2。
表 2 2组患者临床症状有效率的网状Meta分析结果Table 2. Results of reticular meta analysis of effective treatment of clinical symptoms in two groups of patients组别 OR（95%CI） OR（95%CI） OR（95%CI） 常规+冷冻 1.05 （0.52，2.13） 0.17 （0.09，0.32） 2.43 （0.76，7.74） 0.95 （0.47，1.93） 常规+局药 0.16 （0.12，0.22） 2.31（0.83，6.41） 5.90 （3.13，11.10） 6.20 （4.53，8.49） 常规 14.32 （5.42，37.85） 0.41 （0.13，1.31） 0.43 （0.16，1.20） 0.07 （0.03，0.18） 常规+局药+雾化 网状Meta排序结果显示，在提高临床症状治疗有效率方面，常规+局药+雾化（95.8%） > 常规+局药（53.1%） > 常规+冷冻（51.0%） > 常规（0.0%），见图4A 。
图 4 累积概率排序图A：临床症状有效率的累积概率排序图；B：纤维支气管镜下有效率的累积概率排序图；C：治疗后8周末痰菌转阴率的累积概率排序图；D：治疗后24周末痰菌转阴率的累积概率排序图；E：不良反应发生率的累积概率排序图。Figure 4. Cumulative probability ranking chart2.3.2 纤维支气管镜下治疗有效率
10项研究[9，12，14，18，26-27，34-35，37，40]报道了纤维支气管镜下治疗有效率。证据关系见图3B。网状 Meta分析结果表明，与常规疗法比较，常规+冷冻[OR = 7.55，95%CI（2.98，19.15），P < 0.05]、常规+局药[OR = 9.94，95%CI（5.94，16.65），P < 0.05]、常规+局药+雾化[OR = 9.87，95%CI（4.68，20.83），P < 0.05]均可显著提高纤维支气管镜下有效率，差异具有统计学意义（P < 0.05）。但是不同干预措施之间两两相互比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），见表3。网状Meta排序结果显示，在提高纤维支气管镜下有效率方面，常规+局药（73.3%） > 常规+局药+雾化（71.8%） > 常规+冷冻（54.9%） > 常规（0.0%），见图4B。
表 3 2组患者纤维支气管镜下治疗有效率的网状Meta分析结果Table 3. Results of reticular meta analysis of the efficacy of fiberoptic bronchoscopy in two groups of patients组别 OR（95%CI） OR（95%CI） OR（95%CI） 常规+冷冻 1.32 （0.45，3.82） 0.13 （0.05，0.34） 1.31 （0.40，4.31） 0.76 （0.26，2.20） 常规+局药 0.10 （0.06，0.17） 0.99 （0.40，2.46） 7.55 （2.98，19.15） 9.94 （5.94，16.65） 常规 9.87 （4.68，20.83） 0.76 （0.23，2.52） 1.01 （0.41，2.50） 0.10 （0.05，0.21） 常规+局药+雾化 2.3.3 治疗后8周末痰菌转阴率
16项研究[4，6，7，9，13，15，17，19，25-27，30，34-35，40-41]报道了治疗后8周末痰菌转阴率。证据关系见图3C。网状 Meta分析结果表明，与常规疗法比较，常规+局药[OR = 5.92，95%CI（4.09，8.59），P < 0.05]、常规+局药+雾化[OR = 2.70，95%CI（1.31，5.54），P < 0.05]均可显著提高患者治疗后8周末痰菌转阴率，差异具有统计学意义（P < 0.05）。与常规+冷冻相比，常规+局药[OR = 3.10，95%CI（1.34，7.14），P < 0.05]，可显著提高患者治疗后8周末痰菌转阴率，差异有统计学意义（P < 0.05）。而常规与常规+冷冻相比、常规+局药与常规+局药+雾化相比、常规+冷冻与常规+局药+雾化相比，差异均无统计学意义（P > 0.05），见表4。网状Meta排序结果显示，在提高治疗后8周末痰菌转阴率方面，常规+局药（99.0%） > 常规+局药+雾化（58.7%） > 常规+冷冻（40.6%） > 常规（1.7%），见图4C。
表 4 2组患者治疗后8周末痰菌转阴率的网状Meta分析结果Table 4. Results of reticular meta analysis of negative probability of sputum culture in two groups at the end of 8 weeks of treatment组别 OR（95%CI） OR（95%CI） OR（95%CI） 常规+冷冻 3.10 （1.34，7.14） 0.52 （0.25，1.11） 1.41 （0.50，3.98） 0.32 （0.14，0.74） 常规+局药 0.17 （0.12，0.24） 0.45 （0.20，1.02） 1.91 （0.90，4.04） 5.92 （4.09，8.59） 常规 2.70 （1.31，5.54） 0.71 （0.25，2.00） 2.20 （0.98，4.94） 0.37 （0.18，0.76） 常规+局药+雾化 2.3.4 治疗后24周末痰菌转阴率
16项研究[6，8，10-11，13，19，21，23-25，28-29，34，36，38，41]报道了治疗后24周末痰菌转阴率。证据关系见图3D。网状 Meta分析结果表明，与常规疗法比较，常规+局药[OR = 2.85，95%CI（1.88，4.32），P < 0.05]可显著提高患者治疗后24周末痰菌转阴率，差异具有统计学意义（P < 0.05）。而常规+冷冻与常规、常规+局药+雾化与常规、常规+冷冻与常规+局药、常规+局药与常规+局药+雾化、常规+冷冻与常规+局药+雾化比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），见表5。网状Meta排序结果显示，在提高治疗后24周末痰菌转阴率方面，常规+局药（81.7%） > 常规+局药+雾化（63.7%） > 常规+冷冻（46.1%） > 常规（8.4%），见图4D。
表 5 2组患者治疗后24周末痰菌转阴率的网状Meta分析结果Table 5. Results of reticular meta analysis of negative probability of sputum culture in two groups at the end of 24 weeks of treatment组别 OR（95%CI） OR（95%CI） OR（95%CI） 常规+冷冻 1.69 （0.75，3.81） 0.59 （0.30，1.19） 1.49 （0.20，10.87） 0.59 （0.26，1.33） 常规+局药 0.35 （0.23，0.53） 0.88 （0.13，5.93） 1.68 （0.84，3.38） 2.85 （1.88，4.32） 常规 2.50 （0.39，16.13） 0.67 （0.09，4.92） 1.14 （0.17，7.70） 0.40 （0.06，2.58） 常规+局药+雾化 2.3.5 治疗后不良反应发生率
19项研究[5-6，11，15-17，20，22-24，30-34，36，38-40]报道了治疗后不良反应发生率。证据关系见图3E。网状 Meta分析结果表明，常规治疗与3种不同干预措施联合常规治疗的不良反应发生率比较，差异均无统计学意义（P > 0.05），且不同治疗措施之间两两相互比较，差异亦无统计学意义（P > 0.05），见表6。网状Meta排序结果显示，在治疗后不良反应发生率方面，常规+局药（70.3%） > 常规+冷冻（56.3%） > 常规+局药+雾化（43.7%） > 常规（29.7%），见图4E。
表 6 2组患者治疗后不良反应发生率的网状Meta分析结果Table 6. Results of reticular meta analysis of the incidence of adverse reactions in two groups of patients after treatment组别 OR（95%CI） OR（95%CI） OR（95%CI） 常规+冷冻 0.89 （0.35，2.27） 1.24 （0.59，2.61） 1.19 （0.21，6.86） 1.12 （0.44，2.83） 常规+局药 1.38 （0.79，2.42） 1.33 （0.25，7.14） 0.81 （0.38，1.71） 0.72 （0.41，1.26） 常规 0.96 （0.20，4.68） 0.84 （0.15，4.84） 0.75 （0.14，4.02） 1.04 （0.21，5.06） 常规+局药+雾化 2.4 发表偏倚分析
以临床治疗总有效率、纤维支气管镜治疗有效率、治疗后8周末痰菌转阴率、治疗后24周末痰菌转阴率、治疗后不良反应发生率为指标，以每个研究效应量为横坐标，以效应量的标准误为纵坐标，对纳入的38项研究涉及的4种干预措施绘制“比较-校正”倒漏斗图，见图5（A～E）。由图可知，倒漏斗图基本对称，大部分散点落在倒漏斗范围内，提示本研究存在发表偏倚的可能性较小，结论可靠。
图 5 发表偏倚分析图A：临床治疗总有效率的倒漏斗图；B：纤维支气管镜下治疗有效率的倒漏斗图；C：治疗后8周末痰菌转阴率的倒漏斗图；D：治疗后24周末痰菌转阴率的倒漏斗图；E：治疗后不良反应发生率的倒漏斗图。Figure 5. Published bias analysis chart3. 讨论
气管支气管结核是结核病的特殊临床类型，多发于青、中年女性，男女比例为1∶2～1∶3[1]。一项大规模、多中心、前瞻性研究显示[42]，接受支气管镜检查的肺结核患者中约有23.9%患有TBTB，大约59.7%的TBTB患者发生气管支气管狭窄，其中23.3%的患者出现严重的气道狭窄。活动期TBTB早期应用抗结核药物能够减轻患者临床症状、减少气道狭窄、闭塞、软化等并发症的发生。对于初治病例，常规抗结核方案如2HRZE/10HRE，总疗程不低于12个月[1]，但是常规抗结核方案疗效低，无法解决气道瘢痕狭窄、阻塞性肺不张等问题，容易影响TBTB治疗效果。本研究采用贝叶斯网状Meta分析的方法系统评价了常规疗法联合不同介入措施治疗TBTB的疗效差异，旨在为临床选择恰当的治疗措施提供循证参考。
支气管镜下介入治疗是气管支气管结核治疗中的重要手段之一，在常规抗结核药物全身应用的前提下，配合支气管镜下介入治疗可以在一定程度上提高TBTB的治疗效果，减少其所致的各种并发症和后遗症，最大限度地保全患者的肺功能[43]。支气管镜下局部给药可缓解患者临床症状、提高患者免疫功能、显著提高临床疗效[16]，目前，支气管镜下局部给药尚未形成统一指导方案，常用方案如异烟肼（0.05～0.2 g/次）单独[8]或与阿米卡星[13]、链霉素[9]、左氧氟沙星[14]联用，标准抗结核方案联合硫酸卷曲霉素雾化吸入2个月等。
随着支气管镜下局部给药介入技术的发展，也开发出了一些新型吸入性抗结核药物，比如高雾化效率的贝达喹啉可吸入干粉颗粒，体外可有效抑制结核分枝杆菌生长[44]，而且含有贝达喹啉、莫西沙星和吡嗪酰胺的可吸入三重组合粉末制剂，不仅可以对抗耐多药结核病，还可加速痰菌转阴、减少治疗时间、降低口服给药引起的不良反应，但其在动物体内的有效性和安全性需进一步实验验证[45]；卷曲霉素的吸入粉末制剂与静脉制剂相比，在小鼠肺部和血浆中的曲线下面积更高、在血浆中清除速度更慢，有望应用于吸入性结核病的治疗[46]；Rai PY等[47]利用泡腾载体将利福平纳米颗粒进一步转化为喷雾干燥粉末，改善利福平纳米颗粒的再分散性，实现泡腾载体在肺部有效地释放纳米颗粒，从而更好的提高治疗结核病的效率；有研究报道[48]，粘杆菌素可增强莫西沙星+利奈唑胺对耐多药结核病的治疗效果，这为耐多药结核病的治疗提供了新的诊疗思路，但仍有待更多的临床试验来验证该治疗方法在动物体内的有效性和安全性；Spectinamide1599是大观霉素的新型半合成类似物，对结核分枝杆菌具有很强的活性，包括耐多药结核病[49]，研究者对感染了Mtb Erdman菌株的BALB/c小鼠进行长达8周的肺内递送Spectinamide1599联合吡嗪酰胺治疗[50]，结果显示小鼠耐受性良好，没有表现出明显毒性，为Spectinamide1599开发为吸入制剂提供了有力支撑。
支气管镜下冷冻治疗可改善胶原合成，减轻瘢痕组织增生，迅速打通气道狭窄，对淋巴结瘘型、肉芽增殖型、溃疡坏死型TBTB具有良好的疗效和安全性[51]。Ni C等[52]研究了156例气道狭窄合并肺不张的患儿接受支气管镜冷冻治疗前后的治疗效果，结果显示154例患儿治疗有效，临床症状得到明显改善，气道恢复通畅，且均未出现并发症，提示支气管镜冷冻疗法是一种有效且安全的治疗方法。以上3种介入治疗方法均能够提高常规抗结核方案的疗效，从而延长患者生存期并改善生活质量，但仍需要针对不同类型TBTB采取不同的治疗方法，有时需要采取多种方式相结合的综合治疗方法。
本研究共纳入38项RCT研究，结果显示：常规+局药、常规+冷冻、常规+局药+雾化3种方法均可提高TBTB患者的临床症状有效率和纤维支气管镜下有效率，其中常规+局药+雾化治疗方案提高疗效最为显著，而常规+局药治疗方案在提高纤维支气管镜下有效率方面更胜一筹。雾化吸入的风险主要包括：（1）雾化吸入速度过快或者药物过量易导致支气管痉挛；（2）雾化吸入药量过大，持续时间过长，容易导致水分进入肺泡和肺间质引起急性肺水肿；（3）老年和儿童患者因咳痰无力，雾化后导致痰液滞留在气管内，引起气管阻塞。提示临床使用常规+局药+雾化治疗虽然能显著提高患者的临床疗效，但在经支气管镜雾化治疗时，药物用量不宜过大，持续时间不宜过长，吸入速度不宜过快，同时根据不同患者选择个体化雾化方案；在提高临床症状治疗有效率方面，常规+冷冻排在常规+局药+雾化、常规+局药之后，位列第三，原因可能为：（1）冷冻消融比其他介入手段作用慢，具有延迟效应 [1]；（2）经支气管镜冷冻治疗可能会出现局部炎症性水肿，患者易出现胸闷症状；（3）经支气管镜冷冻治疗可能会对支气管壁及黏膜组织造成一定程度损伤，严重时可导致穿孔；（4）经支气管镜冷冻治疗可能会使支气管黏膜受损，从而引发失血性休克。与常规疗法比较，常规+局药与常规+局药+雾化均可提高患者治疗后8周末痰菌转阴率，常规+局药可显著提高患者治疗后24周末痰菌转阴率，提示在临床诊治中，对于TBTB患者早期应用常规+局药+雾化治疗可加速痰菌转阴，但在长期治疗中应用常规+局药治疗方案痰菌转阴效果更佳。在不良反应发生率的比较中，3种治疗方案两两比较，差异均无统计学意义，提示常规抗结核方案的基础上联用支气管镜下介入治疗不会增加不良反应的发生率。本研究存在的缺陷：纳入文献的样本量较小，可能存在一定的局限性，有待纳入高质量、双盲的RCT进一步验证。
综上所述，在常规抗结核方案的基础上联合支气管镜下介入治疗，能够显著改善患者临床症状的治疗有效率和纤维支气管镜下有效率，加快痰菌转阴，且安全性良好，值得临床推广应用。
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图 1 2组胎盘组织中H2S含量比较
与实验组比较，***P < 0.001。
Figure 1. Comparison of H2S content in two groups of placental tissue
图 2 2组胎盘组织中CD31的蛋白相对表达量分析
与实验组比较，***P < 0.001。
Figure 2. Analysis of the relative expression level of CD31 protein between two groups of placental tissues
图 3 2组胎盘组织中VEGFA及VEGFR2的蛋白相对表达量分析
与实验组比较，***P < 0.001。
Figure 3. Analysis of the relative expression levels of VEGFA and VEGFR2 proteins between two groups of placental tissue
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
基因名称 序列（5′→3′） 长度
（bp）PCR产物
长度（bp）ZNF470-F2 CCCCGGCAATCATAATGGAAA 21 95 ZNF470-R2 CTCCCTCTCAAACAAGTCTTCAC 23 ZNF545-F2 GACCTTTAGCCGTGGTTATCATC 23 88 ZNF545-R2 GGCTTTCCAGCATTCCTTACAT 22 GAPDH-F GGACCTGACCTGCCGTCTAG 20 100 GAPDH-R GTAGCCCAGGATGCCCTTGA 20 F：上游引物、正向；R：下游引物、反向。 
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