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早发性脊柱侧凸合并胸廓发育不全综合征幼猪模型的肺发育相关分子分析

代兴飞 李啟堂 严荣爽 张清东 潘呈 费德锐 马裕俭 徐世鑫 张颖

代兴飞, 李啟堂, 严荣爽, 张清东, 潘呈, 费德锐, 马裕俭, 徐世鑫, 张颖. 早发性脊柱侧凸合并胸廓发育不全综合征幼猪模型的肺发育相关分子分析[J]. 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20240508
引用本文: 代兴飞, 李啟堂, 严荣爽, 张清东, 潘呈, 费德锐, 马裕俭, 徐世鑫, 张颖. 早发性脊柱侧凸合并胸廓发育不全综合征幼猪模型的肺发育相关分子分析[J]. 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20240508
Xingfei DAI, Qitang LI, Rongshuang YAN, Qingdong ZHANG, Cheng PAN, Derui FEI, Yujian MA, Shixin XU, Ying ZHANG. Molecular Analysis on the Molecular Mechanism of Lung Development in the Piglet Model of Early Onset Scoliosis Complicated with Thoracic Insufficiency Syndrome[J]. Journal of Kunming Medical University. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20240508
Citation: Xingfei DAI, Qitang LI, Rongshuang YAN, Qingdong ZHANG, Cheng PAN, Derui FEI, Yujian MA, Shixin XU, Ying ZHANG. Molecular Analysis on the Molecular Mechanism of Lung Development in the Piglet Model of Early Onset Scoliosis Complicated with Thoracic Insufficiency Syndrome[J]. Journal of Kunming Medical University. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20240508

早发性脊柱侧凸合并胸廓发育不全综合征幼猪模型的肺发育相关分子分析

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20240508
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(82060414);云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助项目(02101AY070001-150);“兴滇英才支持计划”基金资助项目(XDYC-MY-2022-0026)
详细信息
    作者简介:

    代兴飞(1998~),男,云南曲靖人,在读硕士研究生,主要从事脊柱外科临床工作

    通讯作者:

    张颖,E-mail:zhangyingYNKM@126.com

  • 中图分类号: R682.1+3

Molecular Analysis on the Molecular Mechanism of Lung Development in the Piglet Model of Early Onset Scoliosis Complicated with Thoracic Insufficiency Syndrome

  • 摘要:   目的   基于已建立的早发性脊柱侧凸合并胸廓发育不良综合征(EOS+TIS)幼猪模型及治疗模型获取组织标本,进行转录组测序,生物信息学分析。筛选出影响肺发育相关的部分HUB基因。  方法   建立EOS+TIS及治疗动物模型,进行HE及Masson染色观察肺组织形态及纤维化程度,并对3组(对照组、模型组、治疗组)肺组织测序。利用R软件的DESeq2进行差异分析,运用DAVID数据库进行差异基因的GO/KEGG富集分析,筛选核心基因,预测相关通路,并通过PCR和免疫印迹实验进行验证。  结果   (1)HE染色结果:模型组肺组织体现了显著的支气管肺发育不良,治疗组获得明显改善;Masson染色结果:模型组肺纤维化程度较重,治疗组减轻;(2)DESeq2分析表明,正常组与模型组有170个上调和262个下调基因,而模型组与治疗组有323个上调和467个下调基因;(3)GO功能注释显示差异基因主要富集在细胞外基质、质膜组成、免疫应答、炎症反应、钙离子结合、细胞因子活性等功能。KEGG显示差异基因主要富集在神经活性配体-受体相互作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路;(4)筛选出共同基因THBS1;(5)PCR和Western Blot实验验证,THBS1在模型组中下调,治疗后上调(P < 0.05),使用Western Blot实验检测TGF-β在3组中的表达量,模型组下降,治疗后上升(P < 0.05)。  结论   THBS1与TGF-β参与了早发性脊柱侧凸合并胸廓发育不全综合征幼猪模型的肺发育变化过程。
  • 图  1  HE及Masson染色结果(标尺:100 μm)

    A:对照组肺组织HE染色;B:模型组肺组织HE染色;C:治疗组肺组织HE染色;A1:对照组肺组织Masson染色;B1:模型组肺组织Masson染色;C1:治疗组肺组织Masson染色;红色代表肌纤维,蓝色为胶原纤维。

    Figure  1.  Results of HE and Masson staining ( scale bar 100 μm )

    图  2  3组肺泡计数、肺泡间隔厚度、平均胶原纤维含量测量结果

    A:3组放射状肺泡计数、肺泡间隔厚度;B:3组平均胶原纤维含量。

    Figure  2.  Measurement results of three groups of alveolar count,alveolar septal thickness,and average collagen fiber content

    图  3  差异基因的火山图和热图

    A:模型组与对照组差异基因的火山图,绿色代表下调基因,红色代表上调基因;B:差异基因在模型组与对照组中的热图,蓝色为对照组(CON),红色为模型组(MX);C:治疗组与模型组差异基因的火山图;D:差异基因在治疗组与模型组中的热图,蓝色为模型组(MX),红色为治疗组(ZL)。

    Figure  3.  Volcanic map and heat map of differentially expressed genes

    图  4  模型组与对照组差异基因的GO和KEGG情况

    A:生物学过程(BP);B:细胞组分(CC);C:分子功能(MF);D:KEGG富集结果。

    Figure  4.  GO and KEGG enrichment analysis of differential genes between the model group and the control group

    图  5  粉色为钙离子相关基因、紫色区域代表免疫相关基因、绿色区域代表细胞外基质相关基因

    Figure  5.  Pink represents calcium-related genes,purple area represents immune-related genes,and green area represents extracellular matrix-related genes

    图  6  THBS1在3组中的基因相对表达量情况

    Figure  6.  Relative gene expression levels of THBS1 among the three groups

    图  7  THBS1 WB结果示意图

    Figure  7.  Schematic representation of THBS1 western blot results

    图  8  THBS1在3组中的蛋白相对表达量情况。

    Figure  8.  Relative protein expression levels of THBS1 among the three groups

    图  9  TGF-β WB结果示意图

    Figure  9.  Schematic rpresentation of TGF-β western blot results.

    图  10  TGF-β在3组中的蛋白相对表达量情况

    Figure  10.  Relative protein expression levels of TGF-β among the three groups

    表  1  THBS1及内参的引物序列

    Table  1.   Primer sequences of THBS1 and internal reference

    序列 名称 长度(bp)
    CATCCAAAGCATCTTCAC THBS1(pig)-F 77
    GTGAGAAGGACATTGGTA THBS1(pig)-R
    GTTCCAGTATGATTCCAC GAPDH(pig)-F 56
    GACTCCACAACATACGTA GAPDH(pig)-R
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    表  2  3组幼猪肺组织HE和Masson染色的测量结果($\bar x \pm s$)

    Table  2.   Results of HE and Masson staining in lung tissue of three groups of piglets ($\bar x \pm s$)

    参数 对照组 模型组 治疗组 F P
    放射状肺泡计数(个) 9.24±2.56 6.53±2.08*** 7.88±3.34# 19.25 <0.001
    肺泡壁厚度(μm) 5.81±2.78 12.04±3.10*** 9.44±2.63## 88.37 <0.001
    平均胶原纤维量 0.02±0.01 0.18±0.02*** 0.13±0.02### 1834.28 <0.001
      与对照组比较,***P<0.001;与模型组比较,#P < 0.05,##P < 0.01,###P < 0.001;P < 0.001。
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    表  3  钙离子相关基因

    Table  3.   Calcium ion-related genes

    基因名称LogFCP校正后P
    FBN21.9768061865.53E-471.71E-44
    RCVRN−1.6998434237.65E-101.89E-08
    TENM2−2.2363570952.22E-073.50E-06
    CLSTN2−1.3242353470.011747610.04453978
    TNFAIP61.0612417190.0001946610.001447986
    ACTN21.6830238975.87E-081.04E-06
    DGKB−2.3835198561.67E-072.70E-06
    PON12.5714096286.39E-451.74E-42
    VWDE3.5432265370.0006107340.003897322
    TUBB4A1.4336421820.0078483050.032416471
    THBS1−1.2566104336.47E-864.87E-83
    THBS4−3.2806842770.0001476760.001142492
    MYL4−4.8658024846.08E-214.71E-19
    SCGN3.1507205010.002801260.014003149
    EGFLAM−1.0485617420.0004003310.002700883
    VSNL11.4827999056.29E-091.33E-07
    SYT10−3.8513261650.0063013790.027241397
    EFHD1−1.0842426491.75E-050.000178469
    ANXA9−1.1116303952.47E-128.42E-11
    ASTN2−1.2028676556.21E-050.000542506
    LOC1005227871.0876789460.0090576740.036435259
    PPEF21.5579615670.0031202760.015314764
    UMODL11.2775935640.0067119260.028675953
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    表  5  免疫应答相关基因

    Table  5.   Genes related to immune response

    基因名称 LogFC P 校正后P
    CD274 −1.171256037 2.60E-17 1.49E-15
    SLA-DRB1 1.337022797 3.35E-38 6.62E-36
    JUN −1.850222012 6.44E-158 3.44E-154
    CXCL8 −1.561364145 2.25E-38 4.50E-36
    OSM −1.138466837 1.79E-05 0.000182168
    CXCL14 −1.021217549 2.23E-09 5.16E-08
    CXCL2 −1.789799638 1.19E-37 2.27E-35
    THBS1 −1.256610433 5.47E-86 4.87E-83
    IL1A −1.242147858 2.09E-21 1.64E-19
    CCL8 −1.300951991 4.26E-26 4.32E-24
    CTSL −2.367477476 5.27E-05 0.000470351
    IL1B −1.733900902 8.48E-19 5.37E-17
    SLA-2 1.181319808 3.31E-28 3.87E-26
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    表  4  细胞外基质相关基因

    Table  4.   Genes related to extracellular matrix

    基因名称LogFCP校正后P
    ASAH2−1.6811888580.0102022710.039995696
    TNFAIP61.0612417190.0001946610.001447986
    PON12.5714096286.39E-451.74E-42
    WFIKKN21.0009826326.38E-101.60E-08
    KLK53.1989813330.0116021270.04414435
    CD1E1.4123614411.11E-071.86E-06
    CXCL14−1.0212175492.23E-095.16E-08
    THBS1−1.2566104335.47E-864.87E-83
    AREG−2.3938967051.88E-062.43E-05
    CXCL2−1.7897996381.19E-372.27E-35
    THBS4−3.2806842770.0001476760.001142492
    ADAMTS4−1.0208446029.62E-091.97E-07
    CCL8−1.3009519914.26E-264.32E-24
    CTSL−2.3674774765.27E-050.000470351
    FLRT13.0286063660.0012347950.007069199
    OTOG1.4196562490.0015497840.008528336
    CCL2−1.0033099621.86E-062.40E-05
    NDP1.2975770980.0010277280.006056795
    APOB−1.670375210.0004256580.002851356
    XDH4.9457186582.01E-701.11E-67
    COL22A1−3.0127024440.0016772490.009126374
    BMP8A−1.1313930161.58E-093.74E-08
    DKK1−1.38414672.94E-107.75E-09
    IL1A−1.2421478582.09E-211.64E-19
    IL6−1.8284586386.10E-078.74E-06
    SFRP2−2.2147204820.0122702950.046204564
    TG2.3891667010.0001289180.001023048
    CILP−1.0308552742.52E-128.58E-11
    IL1B−1.7339009028.48E-195.37E-17
    IFNE−1.1479865340.0025830790.013078573
    UPTI1.3100126340.001209190.006944936
    DPEP1−1.7261385910.0020188310.01068401
    LOC100521998−4.0451742130.0067752990.028877436
    ACPP1.0169635040.001278650.007273515
    UMODL11.2775935640.0067119260.028675953
    CXCL8−1.5613641452.25E-384.50E-36
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    表  6  THBS1基因相对表达量($\bar x \pm s$)

    Table  6.   Relative gene expression levels of THBS1 ($\bar x \pm s$)

    基因 对照组 模型组 治疗组 F P
    THBS1 1.04±0.07 0.53±0.06*** 2.08±0.07### 755.75 P < 0.001※※※
      与对照组比较,***P < 0.001;与模型组比较,###P < 0.001;※※※P < 0.001。
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    表  7  THBS1蛋白相对表达量($\bar x \pm s$ )

    Table  7.   Relative protein expression levels of THBS1 ($\bar x \pm s$)

    归一值 对照组 模型组 治疗组 F P
    THBS1 1.00±0.08 0.62±0.08** 0.77±0.10# 15.02 0.005※※
      与对照组比较,**P < 0.01;与模型组比较,#P < 0.05;※※P < 0.01。
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    表  8  TGF-β蛋白相对表达量($\bar x \pm s$)

    Table  8.   Relative protein expression levels of TGF-β ($\bar x \pm s$)

    归一值 对照组 模型组 治疗组 F P
    TGFβ归一值 1.00±0.24 0.55±0.14* 0.91±0.05# 6.07 0.036
      与对照组比较,*P < 0.05;与模型组比较,#P < 0.05;P < 0.05。
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  • 收稿日期:  2024-01-16
  • 网络出版日期:  2024-04-30

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