慢性光化性皮炎 （chronic actinic dermatitis，CAD） 是一种慢性的、能持续影响曝光部位皮肤的光诱导性皮炎，50～70岁的老年男性为好发人群，皮损反复发作可以持续数年乃至更久，这就给CAD的患者带来了极大的痛苦，其病因及发病机制较为复杂，既往研究认为，T细胞亚群与CAD的发生、发展有密切关系^[1]。CAD患者中也可能存在辅助性T淋巴细胞17（Th17 cells）和调节性T淋巴细胞（Treg cells）细胞的失衡，笔者对CAD患者的Th17细胞与Treg细胞的实验室指标作相关性分析，以期为揭示CAD的发病机制提供实验室依据。

1.   资料与方法

1.1   病例资料

收集大理大学第一附属医院皮肤科2017年1月至2018年12月收治并确诊的CAD患者25例，符合Norris和Hawk诊断标准^[2]。同时随机选取20名至大理大学第一附属医院体检的健康志愿者作为对照组，对照组与CAD患者的性别年龄等一般资料，差别无统计学意义，具有可比性（P > 0.05）。CAD患者排除标准^[3]：（1）有其他光敏性皮肤病的患者；（2）对测试的变应原过敏者；（3）有机体抵抗力低下，严重器质性疾病的患者（肝功能衰竭、急慢性肾功能损伤、心肺功能不全、活动性肺结核、甲亢等）；（4）孕妇和哺乳期妇女；（5）测试区有局部感染者；（6）试验之前停用糖皮质激素类药物未达1周及停用免疫抑制剂未达2周，停用抗组胺药未达（2～3）d者。排除标准：（1）测试者拥有CAD诊断标准中的任意一项；（2）近3月来有疾病发生；（3）近期使用过糖皮质激素和/或免疫抑制剂。本研究获得医院伦理委员会批准，入选病例均签署知情同意书。

1.2   研究方法

流式细胞术检测25例CAD患者及20名健康志愿者外周血CD4⁺T淋巴细胞中Th17细胞/Tregd 的比值，同时应用免疫组织化学法检测25例CAD患者和10例健康对照组（因前述健康对照组中有10例志愿者不同意进行皮肤活检，故选取另外10例）皮肤组织皮损白介素-17（IL-17）；叉头转录因子p3 （Foxp3）的表达。

1.2.1   流式细胞仪检测Th17细胞与Treg细胞百分比

人类Treg/Th17试剂盒及同型对照抗体购自BD公司。空腹采集5 mL EDTA抗凝外周血将50 μL EDTA抗凝外周血加入离心管封口，40 ℃低温孵育15 min；按Treg/Th17试剂盒说明依次加入抗体充分混匀后，孵育30 min，进行表面标记；加入红细胞裂解液 2 mL，4 ℃避光孵育10 min，1200 r/min离心5 min，弃上清；加入流式染色缓冲液，1200 r/min离心5 min，离心弃上清；重复上述操作1次，使离心管底部颜色接近透明或呈淡黄色；加入0.5 mL 流式染色缓冲液重悬固定，4 ℃保存，2 h内上机检测。使用美国BD公司流式细胞仪[FACS Canto ⅡPlus（3激光10色）]进行检测，上样检测后用Flowjo软件进行分析，自动获得Treg细胞和Th17细胞在外周血CD4⁺T中的百分率。Treg细胞结果判读是否为CD4⁺T细胞中被标记为CD4⁺CD25⁺CD127阴性或弱表达；Th17检测结果判读为CD4⁺CD196⁺CD183^-。

1.2.2   免疫组化法检测IL-17和Foxp3的表达

兔抗人foxp3多克隆抗体及羊抗人IL-17多克隆抗体均购于西格玛奥德里奇贸易有限公司。将标本切片（4 μm厚度）脱蜡、水化、烤片、冲洗后，3%H₂0₂去离子水孵育15 min， PBS冲洗3×5 min，将切片置于EGTA抗原修复液中修复。PBS冲洗3×3 min，除去PBS液，每张切片加非特异性染色阻断剂1～2滴，室温下孵育15 min。倾去，每张切片上滴加1～2滴的一抗试剂。其中鼠抗人 IL-17 多克隆抗体（工作浓度为 1∶200）、兔抗人 Foxp3 多克隆抗体（工作浓度为 1∶200）。切片在4 ℃冰箱过夜后在室温下静置30～60 min，PBS冲洗3×5 min。除去PBS液，每张切片加酶标羊抗鼠或兔IgG聚合物60 μL，室温下孵育15 min。PBS冲洗3×5 min。滤纸除去PBS液，将DAB显色液滴加到切片上，每张切片滴加约60 μL，室温下显色2～3 min，镜下观察切片细胞的变化，当细胞中出现明显棕色或棕黄色颗粒时及时将显色液甩掉，

清水冲洗切片，使显色反应终止。用肺鳞癌组织、小肠上皮组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，HE染色作组织学对照。以细胞质和（或）细胞核有棕黄色或深褐色颗粒为阳性。Foxp3阳性定位于淋巴细胞中细胞核，胞核内出现棕黄色颗粒为阳性，IL-17阳性定位于淋巴细胞中细胞浆，胞浆内出现棕黄色或褐色颗粒为阳性。光镜下每张切片中选取淋巴细胞较多的5个高倍视野。根据5个视野中出现阳性细胞的个数来计算百分比：胞核或胞浆在显微镜下显色呈棕黄色或棕褐色的细胞个数≥6%为阳性；<5%为阴性（-）。根据细胞着色深浅记分：未着色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐色计3分。以上2种记分总得分除以2为最终得分。0～0.5分为阴性（-）；1～3分为阳性（+）。

1.2.3   CAD患者皮损严重程度评分

按Hanifin J M等据PASI评分修订的EASI 评分表^[4]对25例CAD患者皮损严重程度进行评分。

1.3   统计学处理

使用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，数据由均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，2组间比较使用ｔ检验，以α = 0.05为检验水准，P < 0.05认为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   CAD患者皮损严重程度评分

25例慢性光化性皮炎患者EASI 评分为 6.8～33.95 分，平均（17.42±7.66）分。

2.2   Treg细胞和Th17细胞的流式细胞仪检测结果

Th17细胞原始散点图分区明显，CAD患者Th17细胞分布显著高于对照组（图1～2）；Treg细胞原始细胞散点图细胞分区明显，CAD患者Treg细胞显著低于对照组（图1～2）。与健康志愿者相比，CAD患者Th17细胞在外周血CD4⁺T细胞中所占比例高于对照组，差异具有统计学意义（t = 3.15，P < 0.05）；CAD患者Treg细胞在外周血CD4⁺T细胞中所占比例明显少于对照组，差异具有统计学意义（t = 7.414，P < 0.01）；CAD患者的Th 17/Treg显著高于对照组，差异具有统计学意义（t = 8.930，P < 0.01），见表1。

表  1  各组Th17细胞，Treg细胞比例及Th17/Treg比值（$\bar x \pm s $）

Table  1.  Th17 cells，Treg cell ratio and Th17/Treg ratio in each group

分组	n	Th17（%）	Treg（%）	Th17/Treg
CAD患者	25	16.64 ± 6.12*	3.05 ± 1.29**	5.72 ± 1.68**
健康志愿者	20	11.49 ± 4.44	6.04 ± 1.41	2.01 ± 0.88
t		3.15	7.41	8.93
P		0.001	P < 0.01	P < 0.01
与健康对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  1  CAD患者Treg细胞和Th17细胞的流式细胞仪检测结果

Figure  1.  Results by flow cytometry detection of Treg cells and Th17 cells in CAD

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  2  健康对照组Treg细胞和Th17细胞的流式细胞仪检测结果

Figure  2.  Results by flow cytometry detection of Treg cells and Th17 cells in healthy control group

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   CAD患者Th17细胞、Treg细胞、Th17/Treg比值与EASI 评分相关性分析结果

Th17细胞和Th17/Treg的比值随EASI 评分的增加而增加、Treg细胞随EASI 评分的增加而减少，可初步判断Th17细胞和EASI评分之间、Treg细胞和EASI评分之间以及Th17/Treg比值和EASI评分之间有近似线性关系，进一步做Person直线相关分析：Th17细胞和EASI评分的相关系数r = 0.985，P = 0.000，差异具有统计学意义（P < 0.05），提示2者间存在正相关关系；Treg细胞和EASI评分的相关系数r = -0.846，P = 0.000，差异具有统计学意义（P < 0.05），提示2者间存在负相关关系；Th17/Treg比值和EASI评分的相关系数r = 0.97，P = 0.000，差异具有统计学意义（P < 0.05），提示2者间存在正相关关系，见图3。

图  3  Th17细胞、Treg细胞和Th17/Treg的比值与EASI 评分相关性分析

a：CAD患者Th17细胞与EASI 评分的散点图；b：CAD患者Treg细胞与EASI 评分的散点图；c：CAD患者Th17/Treg比值与EASI 评分的散点图。

Figure  3.  Analysis of EASI score between the ratio of Th17 cells，Treg cells，and Th17/Treg

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   CAD病例组与健康对照组免疫组织化学法检测结果比较

Foxp3阳性染色定位于细胞核，IL-17阳性染色定位于胞浆，CAD病例组Foxp3、IL-17阳性细胞主要分布在真皮浅层淋巴细胞。健康对照组二者仅在部分标本的真皮浅层呈弱阳性表达。CAD病例组与健康对照组间Foxp3比较，差异无统计学意义（χ² = 0.373，P > 0.05）。CAD病例组与健康对照组间IL-17比较，差异有统计学意义（χ² = 19.288，P < 0.05）；见表2、表3、图4（a，b，c，d），图5（e，f，g，h）。

表  2  Foxp3在CAD病例组与健康对照组皮肤中表达差异（n）

Table  2.  The difference of Foxp3 expression in skin （n）

分组	n	阳性	阴性	阳性率（%）	χ2	P
CAD病例组	25	3	22	12	0.373	> 0.05
健康对照组	10	2	8	20

下载: 导出CSV 

| 显示表格

表  3  IL-17在CAD病例组与健康对照组皮肤中表达差异（n）

Table  3.  The difference of IL-17 expression in skin （n）

分组	n	阳性	阴性	阳性率（%）	χ2	P
CAD病例组	25	22	3	88*	19.288	< 0.05
健康对照组	10	1	9	10
与健康对照组比较，*P < 0.05。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  4  健康对照组皮肤组织的免疫组织化学

a：健康对照组 IL-17阴性表达（×100）；b：健康对照组IL-17阴性表达（×200）；c：健康对照组Foxp3阴性表达（×100） ；d：健康对照组Foxp3阴性表达（×200）。

Figure  4.  Immunohistochemistry of skin tissue in healthy control group

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  5  CAD皮肤组织的免疫组织化学

e：CAD组 IL-17阳性表达（ ×200 ）；f：CAD组 IL-17阳性表达（ ×400 ）；g：CAD组 Foxp3阴性表达（ ×200 ）；h：CAD组 Foxp3阴性表达（ ×400 ）。

Figure  5.  Immunohistochemistry of skin tissue in CAD

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

目前普遍认为CAD的发病机制为光敏物质与皮肤结合形成的新抗原诱导的DTH。DTH主要由T淋巴细胞介导，而T淋巴细胞可分为CD4⁺和CD8⁺2大亚群， Treg及Th17细胞均是CD4⁺T细胞的一个亚群。陈浩、邓丹琪等^[5]用免疫组化的方式发现，CAD患者皮损内存在有Th细胞和Tc细胞，在早期主要以CD4⁺T细胞介导的DTH为主，晚期则以CD8⁺T细胞介导的DTH为主。由此推测，在CAD起病的早期过程中，CD4⁺T细胞扮演着重要的角色，尤其是CD4⁺T细胞的2个重要亚群Treg细胞和Th17细胞在慢性光化性皮炎的发生与发展中可能起着重要的作用。

Th17细胞分泌IL-6、IL-17、IL-22、肿瘤坏死因子（TNF-α）等细胞因子实现免疫功能。IL-17在很多种自身免疫性疾病患者的血清和组织中均呈现了极高表达。免疫反应中IL-17有促进炎症发生的重要作用。其功能主要表现在2个方面：在全身性反应中对中性粒细胞的募集、成熟和激活作用，研究发现缺乏IL-17或者Th17会导致中性粒细胞缺陷以及对金黄色葡萄球菌和真菌等抵抗力减弱^[6-7]；另一方面它还能够诱导间充质细胞分泌炎症因子，例如IL-6、IL-8和CCL20，从而加重炎症^[8]。IL-17通过受体与异二聚体复合物相结合来发挥生物学效应^[9]。IL-17在宿主对抗外界病原体的固有免疫防御机制中发挥重要作用^[10]。

本实验中笔者先通过标记CD4⁺CD196⁺CD183^-等表面抗原来界定Th17细胞，结果显示CAD患者Th17细胞在外周血CD4⁺T细胞中所占比例高于健康对照组。免疫组化法同样发现IL-17在CAD皮损中的分布明显高于健康对照组。提示IL-17作为一个重要的促炎因子，在CAD的发病中发挥了重要作用。有研究发现，在CAD的慢性期，CAD患者与健康体检者组的IL-17相比，无统计学差异，推测IL-17主要在疾病的急性期发挥作用^[11]。这也提示可尝试通过影响Th17的增殖分化达到治疗目的，其分泌的细胞因子如IL-17、IL-22，TNF-α可以作为CAD新的治疗靶点，尝试CAD靶向治疗方案。

Treg细胞具有无反应性及免疫抑制性，可通过细胞接触触及分泌的主要细胞因子包括转化生长因子β（TGF-β）和IL-10 发挥其对多种免疫细胞如树突状细胞、NK细胞及单核细胞的抑制作用，同时维持自身免疫耐受及调节内环境稳态。Treg数量减少和功能下降可以导致Treg细胞免疫调节功能受到损伤，这与自身免疫性疾病的发病相关^[12]。本研究先使用CD4⁺CD25⁺CD127^-或弱表达来界定Treg细胞，结果显示CAD患者Treg细胞在外周血CD4⁺T细胞中所占比例显著低于对照组。

Foxp3属于FOX蛋白家族。许多研究已经证明了Foxp3+Treg细胞在控制多种免疫反应的生理和病理中发挥重要作用，包括炎症、自身免疫疾病和癌症^[13-14]。Foxp3 + Treg可以表达高水平的Foxp3，Foxp3长期以来被认为是控制Treg细胞发育和功能的主要调节因子。并且Foxp3的连续表达是维持Treg细胞表型所必需的。本组资料中CAD病例组与健康对照组间Foxp3、IL-17在皮损内的表达结果比较发现，Foxp3在CAD皮损中的表达与健康对照组相似。IL-17在CAD皮损中的分布明显高于健康对照组。这一结果与其他慢性炎性疾病中Foxp3和IL-17的表达情况相同。也与我们用流式细胞术所检测得到的结果是相符的。

与健康志愿者相比，CAD患者的Th17/Treg显著高于对照组，Treg细胞和Th17细胞失衡可能是慢性光化性皮炎的重要的发病机制。这些年来，大量的研究发现了慢性炎症性疾病的发生与发展与Th17/Treg相关，Th17/Treg比值升高，平衡向促炎的Th17细胞方向转化，促使炎症发生^[15-16] 。在CD4⁺T细胞分化成熟过程中，转化生长因子β（TGF-β）不但可以促使原始CD4⁺T淋巴细胞向Treg细胞分化，TGF-β还可以与IL-6一起作用于CD4⁺T细胞，使其转化成为Th17细胞；Th17细胞和Treg细胞比例主要受到TGF-β、IL-6，IL-10，IL-23等细胞因子的影响，因此，它们在外周血中的分化是彼此制约的。调节性T细胞可以在IL-6、IL-1以及TGF-β的共同作用下重新向Th17细胞转化。即Th17细胞和Treg细胞在特定的微环境中它们能够互相转化，并且Th17细胞和Treg细胞之间存在一种动态平衡，机体可以通过改变这种平衡来改变适应性免疫应答的状态；而免疫性疾病、感染以及肿瘤等疾病常常发生在该平衡被打破的时候。在本研究中，CAD患者Th17/Treg显著高于对照组，存在Th17细胞和Treg细胞的失衡，Th17细胞升高水平和EASI评分2者间存在正相关关系；Treg细胞和EASI评分2者间存在负相关关系；Th17/Treg比值和EASI评分2者间存在正相关关系，提示Th17/Treg比值与疾病严重程度相关，Th17细胞水平越高，Treg细胞水平越低，皮损越严重，本研究显示皮损中IL-17表达增高，也提示Th17细胞通过其分泌的细胞因子参与了CAD的炎症过程，发挥了促炎作用。Th17细胞升高，促使平衡向炎症方向转化，可能是CAD发病的重要机制。

综上所述，CAD患者存在Th17细胞和Treg细胞的失衡，Treg细胞及Th17细胞在CAD的发病过程中起着重要作用，急性期CAD患者Th17细胞水平升高，Th17/Treg比值升高，可用来作为判断CAD病情的辅助指标，在将来也许可为CAD的治疗提供新的靶向选择。