Study on the Detection of MMP-2，-7，-9，and -12 Enzymatic Activity Using CEACAM1-Derived Fluorescent Peptide Substrate Site 84
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摘要:
目的 探索CEACAM1 源性多肽合成的荧光底物Site 84 对MMP-2，-7，-9，-12 酶活性的检测，并进一步探索荧光多肽底物Site 84在区分同属于MMPs明胶酶谱中MMP-2和MMP-9的应用。 方法 采用荧光酶学法观察荧光多肽底物Site 84 对MMP-2，-7，-9，-12 酶活性的检测；进一步观察底物Site 84对明胶酶谱中MMP-2和MMP-9酶活性的敏感性和特异性；获得底物Site 84与MMP-2的酶促反应的动力学参数Km、Kcat。 结果 以Site 84 为底物，获得MMP-12、-7、-2 的酶活力曲线，但未获得MMP-9的酶活力曲线；此外，以Site 84 为底物，可特异性检测明胶酶谱中MMP-2 的酶活性，其可检测低浓度（0.6 μM）MMP-2 的酶活性，然而对高浓度（6 μM）MMP-9 未见明显酶促反应；最后，MMP-2 和底物 Site 84的酶促反应动力学参数：Km = 315 μM，Kcat/Km = 2565 / MS。结论 以CEACAM1源性底物 Site 84作为新型的荧光多肽底物，可获得MMP-12、-7、-2 的酶活力曲线，且可特异性检测MMPs明胶酶谱中MMP-2的酶活性。 Abstract:Objective To explore the the detection of MMP-2, -7, -9, and -12 enzymatic activity using the CEACAM1-derived fluorescent peptide substrate Site 84, investigating the application of substrate Site 84 to distinguishing between MMP-2 and MMP-9 in the gelatinase spectrum of MMPs. Methods The fluorescent enzymatic method was employed to observe the detection of MMP-2, -7, -9, and -12 enzymatic activity using substrate Site 84; further observations were made on the sensitivity and specificity of substrate Site 84 to enzymatic activity of MMP-2 and MMP-9 within the gelatinase spectrum; the kinetic parameters （Km and Kcat） of the enzymatic reaction between substrate Site 84 and MMP-2 were obtained. Results Using Site 84 as a substrate, enzymic kinetics curves for MMP-12, -7, -2 were obtained, but no enzymatic activity curve for MMP-9 was observed. Furthermore, Site 84 specifically detected the enzymatic activity of MMP-2 within the gelatinase spectrum, capable of detecting low concentration （0.6 μM） of MMP-2 enzymatic activity, but no obvious enzymatic reaction was observed for high concentration （6 μM） of MMP-9; the kinetics parameters for the enzymatic reaction between Site 84 and MMP-2 were Km = 315 μM, Kcat/Km = 2565 /MS.Conclusion The CEACAM1-derived substrate Site 84 serves as a novel fluorescent peptide substrate, enabling the acquisition of enzymatic activity curves for MMP-12, -7 and -2, and specifically detecting the enzymatic activity of MMP-2 within the MMP gelatinase spectrum. -
Key words:
- Site 84 /
- Fluorescent polypeptide substrate /
- Enzymatic activity /
- Gelatinase /
- CEACAM1-derived.
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基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类主要源自内皮细胞、成纤维细胞及平滑肌细胞等多种细胞的内肽酶家族[1]，其主要通过降解包括弹性蛋白、胶原蛋白、纤维连接蛋白等多种成分组成的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），在胚胎生成和发育、血管生成及伤口愈合等生理过程起着关键作用，同时，其在肿瘤转移、心力衰竭、血栓性疾病、高血压等多种疾病的发生发展过程中也发挥了重要作用[1−4]。通过对MMPs更精准地检测可进一步了解疾病的发生机制，有助于对冠心病等多种心脑血管疾病的早期诊断和预后评估。因此，研发出更准确的MMPs检测技术具有重要意义。目前，检测蛋白酶活性的方法众多，而基于荧光共振能量转移的荧光酶学法操作简便，干扰因素少，现已广泛应用于酶学研究中。有研究表明，血小板CEACAM1 胞外段氨基酸序列中存在多个MMP-12 的酶切位点[5]。因此，本研究拟在此基础上采用多肽合成、荧光酶学法等方法，通过设计含MMP-12 酶切位点的多肽构建荧光底物，探索CEACAM1源性荧光多肽底物与MMP-12 的酶动力学曲线，而由于MMPs 家族间存在底物相似性，同时探索CEACAM1源性荧光多肽底物分别与MMP-2，-7，-9的酶动力学曲线，有望研发出可特异性检测MMP-2，-7，-9，-12 酶活性的新型底物。
1. 材料与方法
1.1 多肽合成
前期研究中已成功表达并纯化CEACAM1细胞外功能区蛋白（Ser34-Thr252，26kDa），将MMP-12与CEACAM1胞外段在37℃孵育过夜，通过SDS-PAGE获得多个酶切片段，并通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、质谱及测序分析，精确定位CEACAM1序列中MMP-12的酶切位点，并成功构建酶切产物的肽指纹图谱[6]。
1.2 主要实验试剂与仪器
委托北京赛百盛生物工程公司化学合成荧光多肽底物Site 84，重组人MMP-2、MMP-9从美国 R&D Systems公司采购获得，APMA及荧光底物XIV从美国Anaspec公司采购获得，GM6001（广谱MMPs抑制剂）从美国MCE公司采购获得，BCA定量试剂盒、考马斯亮蓝R-250染色液、染色脱色液等常用试剂购自中国上海生工公司；Assay Buffer（A）液（mM，w/v，PH 7.4）：50Tris，10 CaCl2，150 NaCl，0.05% Brij-35，Assay Buffer （B）液（mM，w/v，PH 7.4）: 50Tris，20 CaCl2，200 NaCl，0.005% Brij-35；荧光酶学分析仪为美国Thermo公司生产，检测波长：激发/发射（Ex/Em）波长分别为485 nm/538 nm。
1.3 研究方法
1.3.1 荧光酶学法检测MMPs蛋白酶活性
目前检测蛋白酶活性的方法众多，而基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的荧光酶学法操作简便，干扰因素少，可实时检测，动态观察酶促反应进程，现已广泛应用于量化酶促反应的反应速率或动力学参数，研究酶与底物的结合过程，以及用于酶活性的高通量筛选和功能研究等[7]。荧光酶学法检测 MMPs 的活性主要是通过FRET原理：荧光基团和淬灭基团分别结合在 FRET 肽两端，当 FRET 肽未受裂解时，淬灭基团可通过淬灭荧光基团使其无法在激发波长内被检测到；而当其经 MMPs 等活性酶裂解后，荧光基团不受淬灭，荧光强度即可在特定激发/发射（Ex/Em）波长下获得，从而可检测到MMPs酶活性[7]。本研究将荧光基团5-羧基荧光素（5-FAM）结合于合成多肽N端的第1位氨基酸，以及将荧光猝灭基团5-羧基四甲基若丹明（5-TAMRA）结合于第11位氨基酸，即可形成荧光多肽底物[8]。
1.3.2 MMP-2，-7，-9，-12酶原的活化及蛋白浓度的定量
MMP-2、-9 酶原分别加入1mM APMA，37 ℃下各孵育1 h及24 h进行活化，而后采用BCA蛋白定量法分别获得rhMMP-2、-9以及本实验室纯化而得的rhMMP-7、-12的酶浓度；通过BCA蛋白法定量，在获得标准曲线后，计算样品中的蛋白浓度。
1.3.3 MMPs酶活性浓度的测定
DynaFit是一款用于处理生物学或化学中涉及复杂反应动力学的模拟和统计分析的计算软件，可用于研究生化或化学反应的进展，可模拟酶促反应中实验数据，拟合酶促反应中速率常数，使大多原本在理论上可行的计算方法成为现实，同时，可用数值方法准确求出无解的动力学问题[9]。
本研究采用与MMPs紧密结合的可逆性广谱抑制剂GM6001进行酶活性位点滴定获得rhMMP-2、-7、-9、-12的酶活性浓度，通过将不同浓度GM6001抑制MMPs对荧光底物的酶促反应，采用（抑制剂浓度；残余酶活性）数据组代入DynaFit4软件拟合方程[9]。具体实验步骤如下：加入不同体积的rhMMP-2，-7，-9，-12溶液至96孔板（黑色不透明）孔内，终体积45 μL；每孔分别加入等体积（45 μL）的反应缓冲液或以等比稀释的抑制剂GM6001溶液，并与底物Site 2或XIV工作液分别置于37 ℃温育1 h；分别加入10 μL含不同浓度底物XIV或Site 2的缓冲液，获得100 μL反应体系，酶与底物混匀后立即放入荧光酶标仪，37 ℃下用 Ex/Em=485 nm/538 nm的滤光片读取荧光强度，每半分钟识别1次，共识别
1000 次；rhMMP-2，-7，-9，-12酶活性浓度通过DynaFit 4软件得出。以上实验每组重复3次，相对荧光强度（△RFU）以均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示。1.3.4 MMP-2、-7、-9、-12与底物Site 84的酶促反应
在黑色不透明96孔板中加入50 μL反应缓冲液或相同酶活性浓度的rhMMP-2、-7、-9、-12的溶液，分别在37℃下与荧光多肽底物Site 84孵育30 min；每孔加入50 μL孵育后的Site 84工作液，获得100 μL反应体系，rhMMPs酶活性浓度为5 μM，Site 84终浓度为50 μM；酶与底物混匀后立即放入荧光酶标仪，37 ℃下用 Ex/Em=485 nm/538 nm 的滤光片读取荧光强度，每半分钟识别1次，共识别
1000 次；绘制MMP-2，-7，-9，-12与Site 84反应的折线图。以上实验每组重复3次，相对荧光强度（△RFU）以均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示。1.3.5 MMP-2及MMP -9与荧光多肽底物Site 84的酶促反应
在96孔板（黑色不透明）中加入50 μL反应缓冲液或不同酶活性浓度（0.6、3、6 μM）的rhMMP-2、rhMMP-9溶液，分别在37 ℃下与荧光多肽底物Site 84孵育30 min；每孔加入50 μL孵育后的Site 84工作液，获得100 μL反应体系，Site 84终浓度为50 μM；酶与底物混匀后立即放入荧光酶标仪，37 ℃下用 Ex/Em=485 nm/538 nm 的滤光片读取荧光强度，每半分钟识别一次，共识别
1000 次；分别绘制MMP-2、MMP-9与Site 84反应的折线图。以上实验每组重复3次，相对荧光强度（△RFU）以均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示。1.3.6 MMP-2与荧光多肽底物Site 84的酶促反应
在96孔板（黑色不透明）中加入50 μL反应缓冲液或不同酶活性浓度（0、0.15、0.3、0.6、1.2、3、6 μM）的rhMMP-2溶液50 μL，分别在37 ℃下与荧光多肽底物Site 84孵育30 min；每孔加入50 μL孵育后的Site 84工作液，获得100 μL反应体系，Site 84终浓度为50 μM；酶与底物混匀后立即放入荧光酶标仪，37 ℃下用 Ex/Em=485 nm/538 nm 的滤光片读取荧光强度，每半分钟识别一次，共识别
1000 次；绘制不同浓度MMP-2对Site 84水解效率的折线图；绘制MMP-2与Site 84酶动力学曲线，并通过DynaFit 4软件计算出人MMP-2（3 μM）对荧光多肽底物Site 84的酶动力学参数Km、Kcat/ Km。以上实验每组重复三次，相对荧光强度（△RFU）以均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示。1.4 统计学方法
数据分析采用 GraphPad Prism 7.0 统计软件。计量资料以均数±标准差($\bar x \pm s $)表示， P < 0.05 为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 CEACAM1源性荧光多肽底物Site 84的合成
合成的多肽Site 84具备完整的氨基酸序列，经HPLC验证其纯化纯度 > 98%，MS 验证其分子量（molecular weight，MW）1906 Da（图1）。而后，将5-羧基荧光素（5-FAM）荧光基团结合于N端第1位缬氨酸氨基，并将5-羧基四甲基若丹明（5-TAMRA），即荧光猝灭基团结合于第11位赖氨酸氨基，形成荧光多肽底物Site84。
图 1 Site84的高效液相色谱（HPLC）分析图和质谱分析图A：HPLC纯化图，波峰即为Site 84；B：图A中波峰的二次质谱图。Figure 1. HPLC analysis and mass spectrometry analysis of Site 842.2 rhMMP-2，-7，-9，-12酶活性浓度的测定
采用不同浓度GM6001抑制rhMMP-2，-7，-9，-12对荧光底物的酶促反应，采用（抑制剂浓度；残余酶活性）数据组代入DynaFit4软件拟合方程，并求出各rhMMPs的酶活性浓度。经DynaFit 4软件处理后，各rhMMPs酶活性浓度滴定曲线拟合良好，经计算后，rhMMP-2、-7、-9、-12的酶活性浓度分别为（600±137）nM，（701±38）nM，（
1200 ±171）nM，（2640 ±160）nM（图2）。
图 2 rhMMPs酶活性位点滴定A：MMP-12的酶活性浓度；B：MMP-7的酶活性浓度；C：MMP-2的酶活性浓度；D：MMP-9的酶活性浓度。Figure 2. Titration of enzymatic activity sites of rhMMPs2.3 MMP-2、-7、-9、-12与荧光多肽底物Site 84的酶促反应
为明确各MMPs与荧光多肽底物Site 84的酶促反应，本研究将各MMPs的酶活性浓度维持在均一状态后，再分别评估MMP-2、-7、-9、-12与Site 84的酶动力学反应。通过分别将相同酶活性浓度的MMP-2、-7、-9、-12（5 μM）与等浓度的荧光多肽底物Site84（50 μM）在37 ℃下反应，发现MMP-12、MMP-7、MMP-2均可裂解荧光多肽底物Site84，并获得酶活力曲线，发现对Site 84的裂解效率分别是MMP-12 > MMP-7 > MMP-2；而等酶活性浓度的MMP-9与Site 84反应未获得酶活力曲线（图3）。
图 3 MMP-2/-7/-9/-12 与荧光多肽底物Site 84的酶促反应Figure 3. Enzymatic reactions of MMP-2/-7/-9/-12 with fluorescent peptide substrate Site 842.4 明胶酶（MMP-2及MMP-9）与荧光多肽底物Site 84的酶促反应
上述研究发现，以 Site 84 为底物，可获得 MMP-2 的酶活力曲线，而未获得 MMP-9 的酶活力曲线。因此，为明确底物 Site 84 对明胶酶谱活性的特异性检测，本研究将不同酶活性浓度的明胶酶 MMP-2 或 MMP-9 与底物 Site 84 反应，发现 Site 84 可用于检测低浓度（0.6 μM）MMP-2 的酶活性，然而对高浓度（6 μM）MMP-9 未见明显酶促反应（图4）。由此可见，荧光多肽底物 Site 84 与明胶酶反应时可特异性检测 MMP-2 的酶活性。
图 4 明胶酶（MMP-2 及 MMP-9）与荧光多肽底物 Site 84的酶促反应Figure 4. Enzymatic reactions of gelatinases （MMP-2 and MMP-9） with fluorescent peptide substrate Site 842.5 MMP-2与荧光多肽底物Site 84的酶促反应
为明确荧光多肽底物 Site 84 对 MMP-2 酶活性检测的有效性，本研究将不同酶活性浓度的 MMP-2 与底物 Site 84 进行反应，发现随着 MMP-2 酶活性浓度的增加，酶促反应速率也随之增快（图5A），符合酶动力学规律。而后，将底物 Site 84 与 MMP-2 进行酶促反应，到达平台期后，使用DynaFit4软件求出MMP-2 和底物 Site 84 的酶促反应动力学参数：Km为315 μM，Kcat/Km=
2565 /MS（图5B），由此可推测，底物 Site 84作为新型的荧光多肽底物，可有效检测 MMP-2 的酶活性。
图 5 MMP-2与荧光多肽底物Site 84的酶促反应A：荧光多肽底物 Site 84对MMP-2酶活性的检测；B：MMP-2 和荧光多肽底物 Site 84 的酶促反应动力学参数 Km 和 Kcat/ Km。Figure 5. Enzymatic reaction of MMP-2 with fluorescent peptide substrate Site 843. 讨论
3.1 MMPs 及其分类
基质金属蛋白酶可广泛表达于多种组织及细胞，而血小板也可表达和分泌多种MMPs，由血小板释放及心血管系统其他细胞产生的MMPs均可调节血小板功能，在血小板粘附、聚集等过程中发挥重要作用，从而影响冠心病的进程[10−12]。MMPs家族成员结构具有相似性，一般由5个功能不同的结构域组成[13−14]。MMPs可分为六大类，分别是包含MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18的胶原酶，包含MMP-2、MMP-9的明胶酶，包含MMP-3、MMP-10、MMP-11的间质溶解酶，包含MMP-7、MMP-26的基质溶解因子，以MMP-14、MMP-15为主的膜型基质金属蛋白酶，以及以MMP-19、MMP-21为主的其他分泌型MMPs[13]。
3.2 MMP2、-7、-9、-12与冠心病的相关性
MMP-7是最小的MMPs家族成员，主要表达于心肌细胞和巨噬细胞，血小板也可表达MMP-7。MMP-7可降解ECM中的大部分蛋白，还可活化其他的MMPs及TNF-α[15]。此外，有研究发现，MMP-7可能与动脉粥样硬化斑块的易损性密切相关，且在梗死心肌处高表达，可能参与梗死后心室重塑，诱导心衰形成[15- 16]。而在冠心病血清中也发现MMP-7的高表达，预示MMP-7可能参与动脉粥样硬化血栓的形成[17]。
MMP-12除主要在巨噬细胞和平滑肌细胞表达，血小板同样也能产生并释放MMP-12，而MMP-12的释放可通过裂解血小板表面CEACAM1从而降低CEACAM1对血小板因胶原刺激后活化和聚集等反应的抑制效果[6]。另外有研究发现，MMP-12也可能与粥样硬化斑块不稳定密切相关[16，18]，且MMP-12可促进血栓中平滑肌细胞增殖，导致血管管腔变窄[19]。
明胶酶主要降解变性胶原（明胶）和Ⅳ型胶原，主要由MMP-2、MMP-9组成，其在心力衰竭、血栓性疾病等病理过程中发挥重要作用[20−24]。MMP-2主要以酶原形式存在于静息血小板胞质中，血小板活化后，MMP-2酶原从胞质中转移到血小板表面而后释放出大量活性形式的MMP-2。血小板MMP-2可分解蛋白酶活化受体1（protease-activated receptor，PAR1），从而调控血小板受体信号转导，促进血小板聚集[25−26]；血小板MMP-2的释放也可增强剪切应力诱导的血小板活化，并增强血小板在胶原上的粘附作用[27−28]。此外，MMP-2可通过神经-体液调节机制参与心衰的形成，且通过检测血清MMP-2水平，对初发心力衰竭患者心衰早期的MACE事件具有重要的预测价值[14，29]。MMP-9则主要存在于静息和活化状态血小板的α颗粒中[30]，可抑制凝血酶、胶原等激动剂诱导的血小板凝集[31]。MMP-9在缺血性心力衰竭的发展中扮演着角色，且可选择性抑制梗死后心肌重塑，而血清MMP-9水平对于心梗后心血管死亡或心衰进展程度具有重要的预测价值[32−34]。
由此可知，MMPs在多种心血管疾病的进展中发挥重要的作用，因此，测定MMPs的酶活性对冠心病等疾病的预测、诊断或预后有很大帮助。本研究将经MMP-12剪切CEACAM1胞外段后含（A83/I84）酶切位点相邻两段氨基酸序列合成多肽，并在其两端分别加上荧光基团和淬灭基团合成荧光多肽底物，Site 84，探索其与MMP-2、-7、-9、-12的酶促反应情况。研究发现，以Site 84为底物，可获得MMP-12、-2、-7的酶活力曲线，而却未获得MMP-9的酶活力曲线。其中，MMP-12对Site 84裂解效率最强，符合其为MMP-12剪切CEACAM1胞外段后所获得的酶切位点的特点。因此可推测，CEACAM1胞外段源性多肽合成的荧光底物Site 84可能用于检测MMP-12、-2、-7的酶活性。
3.3 荧光多肽底物 Site 84 可特异性区分明胶酶
MMP-2及MMP-9同属于明胶酶，但二者在某些疾病的病理生理过程中所起作用并不完全一致。因此，检测明胶酶谱各成员酶活性，对明确疾病的病理生理过程，及其分别发挥的作用至关重要。但是，由于MMPs家族成员之间具有相似的底物特异性，目前报道的多种荧光多肽底物对明胶酶活性检测特异性较低。因此，构建具有高度敏感，同时对于明胶酶谱可特异性检测出MMP-2活性的底物，对于深入研究明胶酶的功能至关重要。本研究首次发现，荧光多肽底物Site 84可检测到低酶活性（0.6 μM）浓度的MMP-2，然而却未获得与高酶活性浓度（6 μM）MMP-9的酶活力曲线，且MMP-2与Site 84酶促反应动力学参数：Km=315 μM，Kcat/Km=
2565 /MS，表明底物Site 84作为新型的荧光底物，可特异性检测MMPs明胶酶谱中MMP-2的酶活性。可能有助于临床样本MMP-2 酶活性的检测。然而，本研究尚未将Site 84 用于临床样本MMP-2 酶活性的检测，下一步将优化反应条件，继续观察底物Site 84 在冠心病等临床样本中检测MMP-2 酶活性的应用，以及其在MMP-2 抑制剂筛选中的应用。可为进一步研究冠心病等疾病中MMP-2 酶活性的变化和作用机制提供新的方向，以及为研发MMP-2 靶向治疗提供更可靠的思路。 -
图 1 Site84的高效液相色谱（HPLC）分析图和质谱分析图
A：HPLC纯化图，波峰即为Site 84；B：图A中波峰的二次质谱图。
Figure 1. HPLC analysis and mass spectrometry analysis of Site 84
图 2 rhMMPs酶活性位点滴定
A：MMP-12的酶活性浓度；B：MMP-7的酶活性浓度；C：MMP-2的酶活性浓度；D：MMP-9的酶活性浓度。
Figure 2. Titration of enzymatic activity sites of rhMMPs
图 3 MMP-2/-7/-9/-12 与荧光多肽底物Site 84的酶促反应
Figure 3. Enzymatic reactions of MMP-2/-7/-9/-12 with fluorescent peptide substrate Site 84
图 4 明胶酶（MMP-2 及 MMP-9）与荧光多肽底物 Site 84的酶促反应
Figure 4. Enzymatic reactions of gelatinases （MMP-2 and MMP-9） with fluorescent peptide substrate Site 84
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