Screening of Candidate Strains for Coxsackievirus Group A Virus Type 16 Vaccine
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摘要:
目的 手足口病是由肠道病毒感染引起的一种急性传染病，对婴幼儿生命健康造成了严重威胁，柯萨奇A组病毒16型作为主要病原之一，对其疫苗的研究开发显得尤其重要。 方法 对手足口病患者临床标本进行细胞接种及连续传代，对产生细胞病变的收获液通过CA16标准血清进行鉴别试验，阳性样本通过病毒滴度测定、蚀斑纯化、VP1序列同源性及进化分析，筛选疫苗株。 结果 在收集的35份临床口咽拭子样本中，有23份出现细胞病变，经血清学鉴定10份为CA16病毒，阳性率为43.5%。10株病毒经适应性培养，病毒滴度逐渐升高，但从48 h开始趋于稳定，保持在7.0 lgCCID50。毒株蚀斑显示，所有毒株均可形成0.2～0.8 cm的空斑，呈现规则性差异，KM/M08蚀斑大小比较均一。所有毒株均为B1b型，核苷酸的同源性在93.3%～100%，其中KM/M08与其他毒株的同源性最高，在95.2%～100%之间。 结论 通过病毒增殖动力学曲线及其基因同源性、进化分析，KM/M08在上述各方面评价中都比较符合预期筛选标准，拟作为疫苗候选株进行后续研究。 Abstract:Objective Hand, foot, and mouth disease is an acute infectious disease caused by enterovirus infection, which poses a serious threat to the life and health of infants and young children. Coxsackievirus Group 16 is one of the main pathogens. Therefore, the research and development of vaccines for this disease is particularly important. Methods Cell inoculation and continuous passage were performed on the clinical specimens of patients with hand, foot, and mouth disease. The harvested solution with cytopathic effects was identified using CA16 standard serum. Positive samples were screened for vaccine strains through the virus titer determination, plaque purification, VP1 sequence homology and evolutionary analysis. Results Among the 35 collected clinical oropharyngeal swab samples, 23 showed cellular lesions, and 10 were identified as CA16 virus by serology, with a positive rate of 43.5%. After the adaptive cultivation, the virus titers of 10 strains gradually increased, but stabilized at 7.0 lgCCID50 from 48 hours onwards. The plaque of the strain showed that all strains can form plaques of 0.2～0.8 cm, showing the regular differences, and the size of KM/M08 plaques was relatively uniform. All strains were B1b type, with nucleotide homology ranging from 93.3～100%. Among them, KM/M08 had the highest homology with other strains, ranging from 95.2～100%. Conclusion Through the analysis of virus proliferation kinetics curve, gene homology, and evolution, KM/M08 meets the expected screening criteria in all aspects of evaluation and is proposed as a vaccine candidate strain for further researches. -
Key words:
- Hand-foot-and-mouth disease /
- CA16 /
- Vaccine strains /
- Evolutionary analysis
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帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的神经系统退行性疾病，国外报道60岁以上人群患病率大约1%，85岁以上人群患病率大约4%～5%[1-2]。在我国65岁以上人群的患病率为1700/10万，并随年龄增长而升高。其中，早发型PD（early-onset Parkinson’s disease，EOPD）（45岁前发病）约占所有PD病例的3.6 %。PD的发病是因各种原因导致多巴胺能神经元的进行性变性丢失而所致，临床以肌强直、运动迟缓、静止性震颤和姿势不稳等运动症状及非运动症状为特征。帕金森病的发病机制目前尚不明确，可能与遗传因素、环境因素及衰老有关[3-5]。
研究发现[5-6]，在大约3%的帕金森综合征患者中可检测到遗传变异，而在EOPD和常见帕金森病患者中，这一比例可高达77 %。最近的研究已确定了20余个PD（尤其是EOPD病）相关的致病基因，如PRKN （PARK2）、PINK1 （PARK6）、DJ-1 （PARK7）、LRRK2 （PARK8） 等[7-8]。其中，由PRKN基因突变所致的PARK2 约占家族性常染色体隐性EOPD病的50%[9-10]。
PRKN基因包含12个外显子，跨度1.3 Mb，编码蛋白含465个氨基酸残基，具有泛素结合酶（E2s） Ubch7或Ubch8的特征结构域[11]。迄今为止，已报道了400多种已知的PRKN基因突变形式，包括点突变、小插入/缺失、外显子缺失、剪接位点突变和外显子重排等。由PRKN基因突变所致的PD患者临床表现相对不典型，具有发病早、进展慢，对左旋多巴治疗反应良好等特征，与散发性PD相比，临床易出现肌张力障碍等其他运动障碍症状[12]。因此，早期基因筛查和基因型-表型相关分析对这类患者的诊断和发病机制的研究具有重要意义。对于由PRKN突变引起的常染色体隐性青少年帕金森病，已经在体外进行了一些基因治疗的相关研究，有望在临床治疗中用于帕金森病的治疗[13]。本研究通过对2个AREP家系的临床资料分析，并应用下一代测序和MLPA方法进行基因突变检测，希望能进一步促进对AREP的临床表现及基因突变形式的认识与了解。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
本研究中共纳入2个家系中的2名EOPD患者及3名正常成员。详细收集患者的临床表现、病史、体格检查、实验室检查和基因检测结果。根据受试者的临床表现和体格检查，2名患者符合2016年版《中国帕金森病的诊断标准》的诊断标准[14]，诊断为临床确诊PD，而其他家庭成员无PD的临床表现。实验室检查包括甲状腺功能检查和血清铜蓝蛋白检查。临床评估按照2016年版《早发型帕金森病的诊断与治疗中国专家共识》[15]用MDS-统一帕金森病评定量表（MDS-UPDRS）、Hoehn和Yahr量表（H&Y）和帕金森病问卷-39 （PDQ-39）进行。采用简易精神状态检查（MMSE）评估认知功能。应用HAMD和HAMA测试患者是否存在情绪障碍。实验室检查包括血常规、肝肾功能、甲状腺功能检查和血清铜蓝蛋白检查等。应用3.0 T磁共振成像的对患者进行了脑结构成像评估。外周血基因组DNA的提取按照试剂盒说明书操作步骤进行。
本研究为回顾性病例报道，通过遵义医科大学附属医院伦理委员会审批[批准号：KLL-2022-691]。纳入本研究的患者及其家庭成员均被告知本研究的目的，并获得了知情的书面同意。
1.2 基因检测
用EDTA抗凝管抽取2名患者及家系一中的父母、姐姐共5名受试者2 mL静脉血。血样送至北京康旭医学检验中心，使用DNA血液微型试剂盒（Qiagen，Hilden，Germany）提取DNA，建立全基因组文库。对先证者样品利用探针捕获富集目标序列和二代测序的方法检测141个已知的与PD、震颤、肌张力障碍和其他运动障碍相关的基因；应用多重连接依赖探针扩增（MLPA）法检测SNCA、LRRK2、PARK2、PINK1、PARK7、ATP13A2、UCHL1、GCH1等基因外显子的重排和大缺失突变，根据荷兰MRC Holland company提供的标准方案，使用SALSA MLPA probe mix试剂盒进行缺失分析。检测到突变后设计特定引物利用Sanger测序或MLPA法进一步证实并进行家系分析。查询HGMDpro数据库的报道情况并参考ACMG指南对突变的致病性进行评级。对于内含子变异进一步运用罕见病数据库中心在线生物信息学预测工具（rddc.tsinghua-gd.org/search-middle?to=PathoPredicModel）进行剪接型分析预测。
2. 结果
2.1 临床特点
本研究共调查了2家系共2名患者。表1汇总了2名患者的详细临床特征和量表评估。家系2患者除存在PRKN基因突变（3~4号外显子纯合缺失变异）外，还存在LRRK2基因c.4827+6T>A杂合变异及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492* 杂合变异。2名患者的临床表现显示出一些相似性，例如早发、进展缓慢，对小剂量左旋多巴反应良好。但这2例患者的表型也存在一定差异。首先是首发症状不同：家系1患者以右上肢静止性震颤起病，家系2患者表现为僵硬和运动迟缓起病。其次是：家系2患者病程早期出现下肢肌张力障碍和姿势不稳，家系1的患者整个病程中未出现类似症状；家系2患者的自主神经功能障碍症状多且更为明显，相比而言，家系1的患者自主神经功能症状不明显。最后，家系2患者的生活质量较家系1的患者差，PDQ-39评分为18分，家系2患者的UPDRS-III、HAMD 评分均较高（表1）。2名患者的血常规、肝功能、肾功能、甲状腺功能、血清铜蓝蛋白等血液检查均正常。
表 1 2名EOPD患者的临床特征及基因突变结果Table 1. Clinical characteristics and gene mutation results of 2 EOPD patients临床特征 家系1患者 家系2患者 性别 女 女 发病年龄（岁） 29 28 疾病持续时间（年） 3 13 静息震颤 + ++ 肌强直 + ++ 运动缓慢 + ++ 姿势不稳 − ++ 剂末现象 − + 开期/关期 − + 自主神经功能障碍 − ++ 快速动眼睡眠行为障碍 − + 嗅觉障碍 − + 起病时肌张力障碍 − + 反射亢进 − + 精神症状 − + 对左旋多巴反应性 + + Hoehn-Yahr 1.5 2.5 UPDRS III score 11 29 MMSE 25 20 HAMD 4 20 HAMA 2 8 PDQ39 4 18 基因检测结果 PRKN基因的复合杂合突变：
2号外显子杂合缺失变异、
c.619G>T/p.Glu207Ter*杂合变异PRKN基因：3-4号外显子纯合缺失变异；
LRRK2基因：c.4827+6T > A杂合变异；
PINK1基因：c.1474C>T/p.Arg492* 杂合变异“+”表示“存在”，“−”表示“不存在”；UPDRS III：统一帕金森病分级量表第三部分；NMSS：帕金森病非运动症状评分；MMSE：简易精神状态检查；HAMD：汉密尔顿抑郁量表；HAMA：汉密尔顿焦虑量表；PDQ39：帕金森病问卷。 2.2 基因检测结果
基因检测结果发现家系1的患者（图1A，II-2）存在PRKN基因2号外显子杂合缺失变异和c.619G>T/p.Glu207Ter*杂合变异2种突变（图1B，C），患者的父亲及姐姐携带c.619G>T/p.Glu207Ter*杂合变异（图1D，E），不携带PRKN基因2号外显子杂合缺失（图1F，G）；患者的母亲携带PRKN基因2号外显子杂合缺失（图1H），而不携带c.619G>T/p.Glu207Ter*变异（图1I），提示该复合杂合变异与疾病存在家系共分离。家系2只采集有患者的血样品，发现患者（图2A，II-2）存在PRKN基因3~4号外显子纯合缺失变异（图2B），另外发现患者存在LRRK2基因c.4827+6T>A杂合变异（图2C）及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492*杂合无义变异（图2D）；生物信息学分析发现LRRK2基因的c.4827+6T>A变异可能导致剪切改变，插入332 bp碱基造成移码提前终止翻译成截短蛋白（图3）。2名患者未检测到与PD、震颤、肌张力异常和其他运动障碍相关的一些基因的其他突变。根据美国医学遗传学与基因组学学会指南的相关内容，PRKN基因的2号外显子缺失、3~4号外显子缺失、c.619G>T/p.Glu207Ter*变异，LRRK2基因的c.4827+6T>A变异及PINK1基因的c.1474C>T/p.Arg492* 变异均被评级为致病变异，文献复习发现这些突变在国内外人群中有杂合形式的报道，但家系1患者的PRKN基因复合杂合突变形式及家系2患者同时携带3个PD致病基因突变的突变形式均未见报道。
图 1 家系1的系谱图及基因测序图A：家系1系谱图；B：患者（先证者，II-2）存在PRKN基因c.619G>T/p.Glu207Ter*杂合变异；C：患者（先证者，II-2）存在PRKN基因2号外显子杂合缺失；D：患者父亲（I-1）携带PRKN基因c.619G>T/p.Glu207Ter*杂合变异；E：患者姐姐（II-1）携带c.619G>T/p.Glu207Ter*杂合变异；F：患者父亲（I-1）不携带PRKN基因2号外显子杂合缺失；G：患者姐姐（II-1）不携带PRKN基因2号外显子杂合缺失；H：患者的母亲（II-2）携带PRKN基因2号外显子杂合缺失；I：患者的母亲（II-2）不携带PRKN基因c.619G>T/p.Glu207Ter*变异。Figure 1. Pedigree and gene sequencing of family 1
图 2 家系2的系谱图及基因测序图A：家系2系谱图；B：患者（先证者，II-2）存在PRKN基因3-4号外显子纯合缺失变异； C：患者（先证者，II-2）存在PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492* 杂合无义变异；D：患者（先证者，II-2）存在 LRRK2基因c.4827+6T>A杂合剪接型变异。Figure 2. Pedigree and gene sequencing of family 2
图 3 LRRK2基因c.4827+6T>A变异的剪接预测（https://rddc.tsinghua-gd.org/tools/patho-predic/result?uuid=005c2fe7-8ebf-4489-a3b0-802b42aeabfb）LRRK2基因的c.4827+6T>A变异可能导致剪切改变，插入332 bp碱基造成移码而提前终止翻译成截短蛋白。Figure 3. Splicing prediction of LRRK2 gene c.4827+6T>A mutation3. 讨论
PRKN基因（NM_004562.2）定位于染色体6q25.2q27，其突变导致编码的parkin蛋白功能丧失在常染色体隐性遗传青少年帕金森综合征（AR-JP）的发病机制中起重要作用。Kitada[16]于1998年首次报道了导致常染色体隐性帕金森综合征的PRKN基因的缺失突变。随后，发现了该基因的多种突变，包括错义突变、无义突变、截段、缺失、重复和移码。目前已经报道了400多种已知的PRKN基因变异。这些突变可以以纯合、杂合和复合杂合状态存在，外显子重排，包括缺失和重复，占致病变异的50%以上，比点突变或小的插入/缺失更有可能是致病变异，导致症状更早出现。
在这项研究中，笔者筛选了2个患者中141个先前报道的与帕金森病、震颤、肌张力障碍和其他运动障碍相关的基因的点突变和缺失突变，在家系1的先证者中发现了PRKN基因的无义突变与2号外显子缺失突变的新的复合杂合突变，家系共分离分析提示这2种变异分别来自父母亲，与疾病存在共分离。这些证实了新的复合杂合突变的PRKN基因是此EOPD家庭的致病突变。家系2的先证者存在的PRKN基因3~4号外显子纯合缺失变异，推测可能来自于父母亲，是一已知突变形式。与其他报道的携带此类突变的患者相比，本研究家系2的患者临床发病年龄更早，症状更重，病情进展更快。可能与该患者存在LRRK2基因c.4827+6T>A杂合变异及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492* 杂合无义变异有关。笔者运用生物信息学分析发现LRRK2基因的c.4827+6T>A变异可能导致其剪切改变（图3）。
由PRKN基因编码的parkin蛋白由465个氨基酸组成，包括N端的一个Ub样（Ubl）结构域和4个环样结构域。作为E3泛素（Ub）连接酶，parkin与E1 （Ub激活）和E2 （Ub结合）共同参与蛋白酶体降解蛋白异常积累的泛素化。parkin功能障碍会损害线粒体的生物合成，导致线粒体功能降低，而受损线粒体的积累导致多巴胺能神经元变性[17]，Parkin可与PINK1及LRRK2蛋白相互作用，在线粒体自噬及囊泡运输等细胞功能起重要作用，一种蛋白的功能障碍会影响与其互作的蛋白质功能[18]。本研究家系2的患者比其他报道的携带此类突变的患者的临床发病年龄更早，症状更重，病情进展更快，推测可能是因为同时存在Parkin、PINK1及LRRK2突变，对细胞功能影响更大有关。这有待于进一步的蛋白质功能研究。
本研究的主要局限是样本量小。因此，表型分析的结果可能会有一定的偏差，需要进行更大样本量的进一步研究或多中心研究来验证报告的发现。其次，研究突变的蛋白质功能改变是从预测软件中获得的。虽然预测软件可以帮助笔者了解这些变异的功能，但最终需要具体的功能研究来验证它们在PRKN基因相关PD中的作用。本研究首次报道了1个EOPD家系存在PRKN基因2号外显子缺失变异和c.619G>T/p.Glu207Ter*变异的复合杂合变异。在另外1个EOPD家系首次发现了PRKN基因3~4号外显子纯合缺失合并LRRK2基因c.4827+6T>A杂合变异及PINK1基因c.1474C>T/p.Arg492* 杂合变异。然而，这项研究有一些局限性，笔者在一个家系中无法从先证者的父亲、母亲及其他家庭成员那里采集血样。后续将继续随访这个家庭的所有成员。
综上，笔者在2例EOPD病患者中发现了PRKN基因新的复合杂合变异。比较2例患者的临床症状还发现，存在PRKN基因突变合并PD其他致病基因变异患者的临床发病年龄更早，症状更重更复杂，病情进展更快。提示EOPD患者具有典型的临床异质性及遗传异质性。
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图 1 10株病毒在Vero细胞上适应性生长（100×）
Figure 1. Adaptive growth of 10 viral strains on Vero cells（100×）
图 2 10株病毒在Vero细胞增殖动力学分析
Figure 2. Kinetic analysis of the proliferation of 10 viruses in Vero cells
图 3 10株病毒在Vero细胞蚀斑形态分析
Figure 3. Plaque morphology analysis of 10 virus strains in Vero cells
图 5 CA16毒株进化树构建及其分析
Figure 5. Construction and analysis of phylogenetic tree of CA16 strains
图 6 KM/M08在Vero细胞上连续进行蚀斑克隆筛选
Figure 6. KM/M08 was serially screened for plaque clones on Vero cells
表 1 VP1扩增引物序列
Table 1. Primer sequences for VP1 amplification
引物名称 序列 （5' –3' ） 扩增长度 （bp） CA16-VP1F GGACTTCGGGTTGCAGTCTTCTG 1229 CA16-VP1R AGTCGTTATGCGTGGCAAGGTGT 
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