Screening of Candidate Strains for Coxsackievirus Group A Virus Type 16 Vaccine
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摘要:
目的 手足口病是由肠道病毒感染引起的一种急性传染病，对婴幼儿生命健康造成了严重威胁，柯萨奇A组病毒16型作为主要病原之一，对其疫苗的研究开发显得尤其重要。 方法 对手足口病患者临床标本进行细胞接种及连续传代，对产生细胞病变的收获液通过CA16标准血清进行鉴别试验，阳性样本通过病毒滴度测定、蚀斑纯化、VP1序列同源性及进化分析，筛选疫苗株。 结果 在收集的35份临床口咽拭子样本中，有23份出现细胞病变，经血清学鉴定10份为CA16病毒，阳性率为43.5%。10株病毒经适应性培养，病毒滴度逐渐升高，但从48 h开始趋于稳定，保持在7.0 lgCCID50。毒株蚀斑显示，所有毒株均可形成0.2～0.8 cm的空斑，呈现规则性差异，KM/M08蚀斑大小比较均一。所有毒株均为B1b型，核苷酸的同源性在93.3%～100%，其中KM/M08与其他毒株的同源性最高，在95.2%～100%之间。 结论 通过病毒增殖动力学曲线及其基因同源性、进化分析，KM/M08在上述各方面评价中都比较符合预期筛选标准，拟作为疫苗候选株进行后续研究。 Abstract:Objective Hand, foot, and mouth disease is an acute infectious disease caused by enterovirus infection, which poses a serious threat to the life and health of infants and young children. Coxsackievirus Group 16 is one of the main pathogens. Therefore, the research and development of vaccines for this disease is particularly important. Methods Cell inoculation and continuous passage were performed on the clinical specimens of patients with hand, foot, and mouth disease. The harvested solution with cytopathic effects was identified using CA16 standard serum. Positive samples were screened for vaccine strains through the virus titer determination, plaque purification, VP1 sequence homology and evolutionary analysis. Results Among the 35 collected clinical oropharyngeal swab samples, 23 showed cellular lesions, and 10 were identified as CA16 virus by serology, with a positive rate of 43.5%. After the adaptive cultivation, the virus titers of 10 strains gradually increased, but stabilized at 7.0 lgCCID50 from 48 hours onwards. The plaque of the strain showed that all strains can form plaques of 0.2～0.8 cm, showing the regular differences, and the size of KM/M08 plaques was relatively uniform. All strains were B1b type, with nucleotide homology ranging from 93.3～100%. Among them, KM/M08 had the highest homology with other strains, ranging from 95.2～100%. Conclusion Through the analysis of virus proliferation kinetics curve, gene homology, and evolution, KM/M08 meets the expected screening criteria in all aspects of evaluation and is proposed as a vaccine candidate strain for further researches. -
Key words:
- Hand-foot-and-mouth disease /
- CA16 /
- Vaccine strains /
- Evolutionary analysis
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近年来，手足口病（hand-foot-mouth diseases，HFMD）在亚洲-环太平洋地区不断暴发且呈逐年增加的态势，对婴幼儿的生命健康造成了严重的威胁[1−2]。我国自2008年安徽阜阳暴发手足口病以来，疾病的防控形势异常严峻，随后该病被列为丙类传染病进行管理[3−4]。肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇A组病毒16型（Coxsackievirus A16，CA16）作为引起手足口病的两种重要病原体越来越受到人们的重视，随着EV71灭活疫苗的成功上市[5]，由EV71感染导致的手足口病病例逐步减少，CA16成为引起手足口病的主要病原体[6]。此外，由CA16病毒感染引发的重症病例和反复感染的比例不断增加[7]，防控形式依然十分严峻，因此开发针对CA16或者与EV71联合疫苗显得尤其紧迫和重要[8−9]。本研究对采集的手足口病患者临床咽拭子样品进行病毒的分离、鉴定，对得到的CA16毒株进行病毒扩增、稳定性传代、蚀斑克隆纯化、基因同源性及进化分析比较，筛选疫苗候选株，为CA16疫苗研发提供前期基础。
1. 材料与方法
1.1 细胞培养
本研究中用于病毒分离的Vero细胞和病毒传代培养的KMB17细胞均来源于中国医学科学院医学生物学研究所。细胞所用的培养基为DMEM溶液（Gibco，USA），血清为10%小牛血清（Gibco，USA）。
1.2 病毒分离及适应性培养
把Vero细胞悬液加入到T25细胞瓶中，待其生长成单层细胞后，去掉旧培养液，取上述临床样本0.5 mL接种到到细胞表面，37 ℃孵育30 min，然后加入DMED-1%小牛血清维持液，37 ℃培养3～5 d，可见细胞出现典型变圆、折光性增强、脱落等细胞病变特征。待80～90%细胞病变后，细胞培养液在−20 ℃反复冻融2～3次，收集全部细胞培养液，于−80 ℃冰箱保存。
1.3 病毒滴度测定
把分离的病毒进行10倍梯度稀释，每孔0.1 mL接种到96孔长成单层的Vero细胞中，每个稀释度接种8孔置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，用倒置显微镜每日检查细胞病变情况，接种7 d后按照按Reed-Muench公式计算病毒的感染性滴度。
1.4 病毒在细胞上的适应培养及传代
把KMB17细胞悬液加入到含有8%小牛血清的DMEM培养基中，然后转入到T25细胞瓶中，待其长成单层细胞后，丢弃旧培养液。取在Vero细胞上收获的第5代CA-16病毒收获液0.5 mL与KMB17细胞在37 ℃孵育30 min，加入DMEM-1%小牛血清的维持液，待细胞出现80%病变时，收集病毒收获液，冻存于−80 ℃冰箱备用，后续适应性传代按上述方案进行。
1.5 病毒鉴定及蚀斑克隆纯化
利用CA16标准血清，对上述细胞收获液进行鉴别试验，取在KMB17细胞感染病变的CA16收获液，按10倍稀释到10−5 PFU，分别加到形成单层的KMB17细胞中，37 ℃孵育30 min，加入含1%甲基纤维素的DMEM-1%小牛血清培养液，待其凝固后置于37 ℃培养，并在显微镜下观察，直至出现典型的蚀斑后，用巴氏管吸取相应的蚀斑，转入1.5 mL的离心管中，加入1 mL PBS，捣碎后后离心取上清，按上述的方法再克隆纯化1次。第2次蚀斑克隆得到的病毒用于在KMB-17细胞上进行传代。
1.6 病毒基因组核酸的提取、逆转录及PCR的扩增
将病毒进行病毒基因组的提取，按照TAKARA病毒核酸提取试剂盒说明书进行，然后用反转录试剂盒进行cDNA的转录。根据CA16标准毒株的序列设计VP1扩增引物，引物序列见表1，将扩增的产物片段链接PMD18-T进行载体链接，然后送测序公司进行测序。
表 1 VP1扩增引物序列Table 1. Primer sequences for VP1 amplification引物名称 序列 （5' –3' ） 扩增长度 （bp） CA16-VP1F GGACTTCGGGTTGCAGTCTTCTG 1229 CA16-VP1R AGTCGTTATGCGTGGCAAGGTGT 1.7 病毒VP1基因及蛋白序列的比较分析
将测序公司返回的序列利用Lasergene软件进行序列的组装和拼接，然后对这些毒株的VP1基因序列进行同源性分析，然后与GenBank中的其他序列进行比较，进行进化树构建，先使用Lasergene软件包进行序列的拼接和同源分析比较，然后用ClustalX version 2.0，进行序列比对，再应用MEGA 5.0软件包进行系统发生分析，以邻位相连法构建系统发生树，分析采用
1000 多个多序列组（replicates）。1.8 统计学分析
本研究数据分析采用GraphPad Prism 10.0统计软件。各组间比较采用Two-way ANOVA方法进行统计，P < 0.05则认为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 毒株分离及鉴别
来自昆明等不同地区的35份临床口咽拭子样本，经震荡混匀、离心、过滤除菌后按100 μl/孔的接种量接种于长满单层Vero细胞的24孔板。接种后3～5 d，有23份样本出现细胞病变，其病变形态基本类似，待80%病变时收获病毒液。利用CA16标准血清，对上述细胞收获液进行鉴别试验，在23份样本中有10份为CA16病毒，阳性率为43.5%，样本编号分别为：G8、168、154、MM7、G20、KM/M08、MG15、A3、B55、C12。
2.2 毒株在Vero细胞上适应性生长
对得到的10株CA16毒株，在Vero细胞上进行适应性传代，在接种后的3～5 d，细胞开始出现变圆、折光性增强、脱落等细胞病变现象，见图1。个别毒株（如G8、MM7）可导致细胞聚集成团，成片脱落等现象。随着传代次数的增加，细胞病变时间从原来的3～5 d，逐渐缩短为2～3 d。第3代后，病变时间较为稳定。
图 1 10株病毒在Vero细胞上适应性生长（100×）Figure 1. Adaptive growth of 10 viral strains on Vero cells（100×）2.3 不同毒株生长特性分析
为进一步了解这10株病毒的增殖特性，对其增殖动力学进行了分析。这10株病毒从接种后的12 h病毒滴度到达了比较高的水平，随着时间的增加，其滴度不断升高，但从48 h开始，其滴度趋于稳定，保持在7.0 lgCCID50，见图2。除了C12外，所有毒株的增殖特性基本保持一致。
图 2 10株病毒在Vero细胞增殖动力学分析Figure 2. Kinetic analysis of the proliferation of 10 viruses in Vero cells2.4 毒株蚀斑形态分析
10株病毒在Vero传至第3代时，在Vero细胞上进行蚀斑克隆分析，10株病毒的蚀斑形态见图3，所有毒株均可形成0.2～0.8 cm的空斑，显微镜下空斑处细胞病变、破裂，染色较正常细胞颜色浅。但各株病毒的蚀斑大小不一，呈现规则性差异。对于同一株病毒，蚀斑大小也不尽相同，还需要进一步的克隆纯化。在这些毒株中，KM/M08蚀斑除极个别小蚀斑外，大小还比较均一。
图 3 10株病毒在Vero细胞蚀斑形态分析Figure 3. Plaque morphology analysis of 10 virus strains in Vero cells2.5 毒株VP1序列同源性及分子进化分析
毒株的分型及是否出现变异对评估CA16流行病的情况起着非常重要的作用，在测定病毒的基础上，笔者进一步对10株病毒的主要抗原VP1基因进行扩增。经过核酸提取、反转录、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析，10株病毒均在
1229 bp处出现明亮条带，大小符合预期。把PCR产物送生物公司测序，经与PUBMED基因数据库比对，这些扩增片段均为CA16毒株序列，实验结果再次得到验证。PCR扩增得到的VP1序列，经过比对，去掉两端的非VP1序列，得到10株病毒完整的基因序列VP1（891 bp）经过Percent identity和Divergence分析，所有毒株核苷酸的同源性在93.3%～100%（图4），未出现较大的变异，其中KM/M08与其他毒株的同源性最高，范围在95.2%～100%之间。
CA16的型别比较多，目前通常认为可分为A型和B型，其中B型又分为B1（B1a、B1b、B1c）、B2。通过基因进化树分析，本研究得到的10株病毒均属于B1b型，见图5。再进一步细分，G8、168、154、MM7、G20与流行株AH08-06处于同一分支，而KM/M08、MG15与国内流行株19M-F3、SH/CHN、YN10-02处于同一分支。特别注意的是，A3、B55与其他分离的毒株进化距离较远，特别是C12与其他9株病毒和国内流行株相比，亲缘关系更远，需要进一步研究其是否出现变异及基因突变等基因特征。
图 5 CA16毒株进化树构建及其分析Figure 5. Construction and analysis of phylogenetic tree of CA16 strains2.6 疫苗候选株克隆筛选
通过病毒增殖动力学曲线及其基因同源性、进化分析，发现KM/M08在上述各方面评价中都比较符合预期筛选的标准。因此，KM/M08拟作为疫苗候选株进行后续的研究。首先，为确保毒种的纯度，对KM/M08进行了一系列的蚀斑克隆筛选。从第3代蚀斑开始，从中挑选大小均一的蚀斑进行后续的传代培养，然后再次进行蚀斑克隆筛选，以此类推，直至第6代。第3、4代蚀斑均有大小不一的现象，以后随着代次的增加，蚀斑形成大小逐步一致、均匀，为后续进一步生产工艺研究提供了基础，见图6。
图 6 KM/M08在Vero细胞上连续进行蚀斑克隆筛选Figure 6. KM/M08 was serially screened for plaque clones on Vero cells3. 讨论
柯萨奇病毒属于小RNA病毒科（Picornaviridas）、肠道病毒属（Enterovirus），与脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒68～71型等病毒同属肠道病毒属[10]。柯萨奇病毒作为人类疾病的重要致病病原，可引起呼吸道感染症状，严重者可造成心肌炎、心包炎及神经系统的一些疾病[11−13]。近年来，由柯萨奇病毒感染的人数不断增加，特别是由CA16感染引起的病例不断增加，对人们的生命健康造成严重的威胁，人们对其也越来越重视[14]。柯萨奇病毒的特点是型别比较多，已经发现的就有30多种，所以产生的抗原性也比较复杂，但不同毒株感染后产生的抗体之间常常存在交叉反应，常常给临床诊断和治疗带来了极大困难。但CA16只有一种血清型，这就为CA16疫苗的研发提供了理论基础[15]。
CA16病毒与已经具备灭活病毒疫苗的EV71病毒均属于肠道病毒，二者具有相似的结构特征[16]。从理论上说，作为小RNA病毒属的成员，二者的抗原组成模式亦十分相近，它们都涉及病毒编码的4个结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，并由其中的3个蛋白组成的衣壳体共同作用于免疫系统而可以诱导完整的免疫反应[17−18]。基于这一推论，CA16灭活疫苗在延续EV71灭活疫苗的工艺制备模式将可以产生有效的免疫效果及相应的临床保护效应[8，19]。
本研究对分离于手足口病患者临床样本进行病毒分离及适应性培养，共得到10株CA16病毒株。这些病毒株经CA16标准血清的鉴别试验及其在Vero细胞上增殖后的生物学特性分析，包括其蚀斑形态、在Vero细胞上的增殖动力学特征、VP1基因的比较分析和基因进化树分析，初步确定了KM/M08毒株做为灭活病毒疫苗毒株，为后续进一步生产工艺开发研究奠定了基础。
目前，关于CA16基因分型还没有统一的标准，国内外的研究通常是以VP1基因序列作为基因分型的主要依据。CA16可分为A和B两种基因型，也有学者认为可分为A、B、C 3种基因型[20]。B型可分为B1和B2两个亚型，其中B1又存在B1a和B1b型。目前针对CA16开展的大量分子流行病学调查研究表明，国内流行的毒株依然是B1a和B1b。本研究所分离的10株全为B1b亚型，这与流行病学研究结果较一致，本研究选用KM/M08毒株为预防手足口病提供了流行病学理论依据。
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图 1 10株病毒在Vero细胞上适应性生长（100×）
Figure 1. Adaptive growth of 10 viral strains on Vero cells（100×）
图 2 10株病毒在Vero细胞增殖动力学分析
Figure 2. Kinetic analysis of the proliferation of 10 viruses in Vero cells
图 3 10株病毒在Vero细胞蚀斑形态分析
Figure 3. Plaque morphology analysis of 10 virus strains in Vero cells
图 5 CA16毒株进化树构建及其分析
Figure 5. Construction and analysis of phylogenetic tree of CA16 strains
图 6 KM/M08在Vero细胞上连续进行蚀斑克隆筛选
Figure 6. KM/M08 was serially screened for plaque clones on Vero cells
表 1 VP1扩增引物序列
Table 1. Primer sequences for VP1 amplification
引物名称 序列 （5' –3' ） 扩增长度 （bp） CA16-VP1F GGACTTCGGGTTGCAGTCTTCTG 1229 CA16-VP1R AGTCGTTATGCGTGGCAAGGTGT 
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