MiR-196b Promotes Proliferation and Migration of Lung Adenocarcinoma by Targeting ERG
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摘要:
目的 探究miR-196b影响肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）进展的机制。 方法 通过TCGA数据库分析miR-196b在LUAD组织中的表达水平，利用TargetScan预测其下游靶基因并用双荧光素酶实验进行验证，qRT-PCR检测miR-196b和ETS相关基因（ETS-related gene，ERG）在LUAD细胞系中的表达情况，MTT、划痕愈合和Transwell实验分别检测不同处理后LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭能力的变化情况。 结果 miR-196b在LUAD中高表达（P = 3.50e-17）并靶向负调控ERG，过表达miR-196b能够促进LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭（P < 0.05），回复实验证实miR-196b/ERG调控轴能够影响LUAD细胞增殖、迁移和侵袭（ P < 0.05）。 结论 miR-196b靶向ERG促进LUAD进展的分子机制，对开发LUAD新的临床治疗方法具有潜在意义。 Abstract:Objective To explore the mechanisms of miR-196b affecting the progression of lung adenocarcinoma （LUAD）. Methods The expression level of miR-196b in LUAD tissues was analyzed through TCGA database. TargetScan was used to predict its downstream target genes, and dual-luciferase assay was performed to validate the predictions. qRT-PCR was used to detect the expression of miR-196b and ETS-related gene （ERG） in LUAD cell lines. MTT, scratch healing, and Transwell assays were used to respectively assess the changes in proliferation, migration, and invasion abilities of LUAD cells after different treatments. Results miR-196b was highly expressed in LUAD （P = 3.50e-17） and negatively regulated ERG. Overexpression of miR-196b promoted proliferation, migration, and invasion of LUAD cells （P < 0.05）. Rescue experiments confirmed that miR-196b/ERG regulatory axis can affect the proliferation, migration, and invasion of LUAD cells （ P < 0.05）. Conclusion The molecular mechanism of miR-196b targeting ERG in promoting the progression of LUAD has potential significance for the development of new clinical treatment methods for LUAD. -
Key words:
- miR-196b /
- ERG /
- Lung adenocarcinoma /
- Proliferation /
- Migration
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肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是最常见的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）类型，其特征是淋巴细胞浸润密集，并且在早期容易发生转移[1]。近年来，随着LUAD的治疗逐渐从传统治疗演变为基于癌细胞基因特征定制的个性化治疗，肺癌患者的预后大幅改善[2]。但目前LUAD仍然容易复发并造成患者死亡，5 a总生存率仍低于15%[3]。因此，有必要探索LUAD发生和转移的潜在机制，这可以为开发LUAD治疗的新方法提供新的途径。
微小RNA（ microRNA ，miRNA）是介导不同分子过程的关键参与者，它们比蛋白质编码基因更常参与肿瘤发生[4]。据报道，miR-196b作为致癌基因参与调控几种癌症的进展，例如结直肠癌[5]和胃癌[6-7]；同时，抑制miR-196b的表达还能够促进神经胶质瘤细胞对替莫唑胺化疗和放疗的敏感性[5]。在肺腺癌中，人们同样发现miR-196b具有促癌作用[8-10]。可见miR-196b在多个癌症中都起到了促癌的作用，但其在LUAD中的作用机制仍需完善。ETS相关基因（ETS-related gene，ERG）是E-26转换特异性（E-26 transformation-specific，ETS）转录因子家族成员之一，在血管生成、造血和骨发育等发育过程中发挥重要作用[11]。ERG作为致癌基因在前列腺癌中起到了很重要的作用，研究发现，ERG是前列腺癌潜在的诊断和预后生物标志物，能够促进前列腺癌细胞的增殖和迁移[12-13]；而在肝癌中，着色性干皮病基因G组（xeroderma pigmentosum group D，XPG）基因过表达可下调ERG的表达，进而抑制肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞的增殖，促进其凋亡[14]。然而，目前ERG在肺腺癌中的作用仍不明确。
本研究前期总结了前人的研究成果，同时利用生信分析发现miR-196b在LUAD中高表达，通过设计实验探究miR-196b是否在LUAD中发挥关键作用，发现miR-196b对LUAD增殖、迁移和侵袭的促进作用是通过靶向负调控ERG基因的表达来实现的。这项研究可能为阐明LUAD肿瘤发生的机制提供新的机会。
1. 材料与方法
1.1 主要材料
本研究使用的培养基DMEM-H和RPMI-1640购自中国北纳生物公司，Lipofectamine® 3000试剂盒、Trizol试剂盒购买自美国Invitrogen公司，PrimeScript RT试剂盒、SYBR Premix Ex Taq购买自日本Takara公司，1 %蛋白酶抑制剂购自美国Sigma公司，聚偏二氟乙烯膜购自美国Millipore公司，基质胶 购于美国BD Bioscience公司，ERG（ab92513，1∶
1000 ）、GAPDH（ab181602，1∶10000 ）、IgG（ab205718，1∶20000 ）抗体购自英国Abcam公司，miR-196b-mimic（miR-mimic）及其阴性对照NC-mimic、miR-196b-inhibitor（miR-inhibitor）及其阴性对照NC-inhibitor、ERG过表达载体（oe-ERG）及其空载体（oe-NC）均购买于GenePharma公司（中国），载体pmiRGLO、荧光素酶测定系统来自美国Promega公司，Applied Biosystems ABI 7500实时PCR系统、RIPA裂解缓冲液、化学发光发色底物、MTT、二甲亚砜购于美国Thermo Fisher Scientific公司，Image Lab软件、酶标仪来自美国Bio-Rad公司，Transwell小室购于美国Corning Costar公司。1.2 生信分析
从癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）（ https://portal.gdc.cancer.gov/） 数据库下载TCGA-LUAD疾病Isoform Expression数据（癌旁组织：46例，肿瘤组织：521例），将样本文件合并成表达量矩阵。从miRBase（ http://www.mirbase.org/） 数据库下载人类miRNA注释文件对表达量进行注释，利用‘edgeR’包[15]对mRNA进行差异分析（|logFC| > 1.5，FDR < 0.05）。基于TCGA数据库下载患者miR-196b的表达量数据与患者生存状况数据，根据这些数据通过‘survive’包绘制K-M曲线。
通过TargetScan数据库（ http://www.targetscan.org/vert_72/），对差异miRNA的下游靶基因进行预测。从TCGA（ https://portal.gdc.cancer.gov/） 数据库选择TCGA-LUAD疾病Gene Expression数据，下载count数据类型（癌旁组织：59例，肿瘤组织：535例）。将样本文件进行合并成表达量矩阵。从GENECODE（ https://www.gencodegenes.org/） 数据库下载人类基因组注释文件对表达量矩阵进行注释提取mRNA表达量矩阵数据，利用‘edgeR’包对mRNA进行差异分析（|logFC| > 1.5，FDR < 0.05）。
1.3 细胞培养
本研究使用的细胞系均购自北纳生物公司，在37 ℃，5 %CO2的条件下培养，培养条件与Zhang等[16]相同。各细胞使用的培养基，见表1。
表 1 研究使用的细胞系及培养基Table 1. Cell lines and media used in the study细胞系 编号 培养基 BEAS-2B BNCC338205 DMEM-H PC-9 BNCC340767 HCC-78 BNCC338064 RPMI-1640 H1395 BNCC255519 Calu-3 BNCC338514 1.4 细胞转染
实验方法参考Sheng K等[17]。利用Lipofectamine® 3000试剂盒将miR-196b-mimic、NC- mimic、miR-196b-inhibitor、NC-inhibitor转染到HCC-78细胞系中，使用定量qRT-PCR确定转染是否成功。同样，利用Lipofectamine® 3000试剂盒将oe-ERG、oe-NC转染到HCC-78细胞系中，使用定量qRT-PCR或Western blot分析确定转染是否成功。
1.5 实时荧光定量PCR
使用Trizol试剂盒从LUAD细胞中提取总RNA。miRNA和mRNA通过PrimeScript RT试剂盒逆转录成cDNA。qRT-PCR由SYBR Premix Ex Taq在Applied Biosystems ABI
7500 实时PCR系统下进行。使用GAPDH作为ERG内源性参照，U6作为miR-196b的内源性参照；引物序列，见表2，所有检测结果均采用2-ΔΔCt值的方法进行分析[18]。表 2 引物序列表Table 2. Primer Sequence Table基因 引物序列（5′→ 3′） miR-196b Forward primer: GTACCACTTTATCCCGTTCACCA
Reverse primer:ATCTCGAGGCAGGGAGAGAGGAATAAU6 Forward primer: GCCCATCTTGACCCGAAT Reverse primer: AACGCTTCACGAATTTGCGT ERG Forward primer:GAGTGGGCGGTGAAAGAATA Reverse primer: GGAGATGTGAGAGAAGAGTG GAPDH Forward primer:CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC Reverse primer:CCCAATACGACCAAATCCGTT 1.6 蛋白质印迹法
将细胞在含有1 %蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液中裂解。在4 ℃下以
16000 r/min离心20 min后，用BCA蛋白测定试剂盒对总蛋白进行定量，然后在98 ℃下变性10 min。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，然后将其转移至聚偏二氟乙烯膜，在含有0.1 % Tween 20（TBST）的配制的5 %脱脂牛奶中封闭1 h，随后，将膜与一抗ERG，GAPDH在4 ℃下过夜孵育。第2天用TBST在室温下洗涤3次后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗IgG在室温下孵育2 h，然后使用TBST洗膜3次。最后通过使用增强的化学发光发色底物进行发光反应，并使用Image Lab软件进行分析[19]。1.7 细胞增殖实验
将HCC-78以每孔
3000 个细胞的密度接种到96孔板中。分别在培养时间0 h、24 h、48 h或72 h时，将细胞与MTT溶液相互作用4 h，弃去上清液，添加100 μL二甲基亚砜溶解甲瓒。使用酶标仪检测570 nm处的吸光度[20]。1.8 划痕愈合实验
将转染的HCC-78细胞以1×105的细胞密度接种在6孔板中并生长至80 %融合。使用200 µL移液器吸头沿直线划伤单层细胞。通过PBS洗涤去除细胞碎片，随后将划伤的细胞在无血清培养基中培养。在划痕后0 h和48 h使用显微镜拍摄图像并记录划痕宽度[21]。
1.9 Transwell 实验
对于迁移测定，将2×104个细胞悬浮在无血清培养基中并接种于上层小室，下室填满30% FBS 培养基。对于侵袭测定，根据制造商的方案，用基质胶包被上室，然后加入含2×104个细胞的无血清培养基，下室填满30% FBS培养基[22]。最后，在显微镜下分别计数用0.1%结晶紫染色的迁移和侵袭细胞并拍照。
1.10 双荧光素酶实验
将含有miR-196b假定结合位点的ERG的3′非翻译区（untranslated region，UTR）以及对应的突变序列插入到载体pmiRGLO中，构建pmiRGLO-ERG-WT、pmiRGLO-ERG-MUT。根据制造商的规程，使用Lipofectamine 3000将ERG-WT或ERG-MUT与miR-mimic或miR-NC共转染到HCC-78 细胞中。转染 48 h后，使用荧光素酶测定系统检测荧光素酶活性[23]。
1.11 统计学处理
所有统计分析均由 GraphPad Prism 6.0进行。数据表示为 $ \mathrm{平}\mathrm{均}\mathrm{值}\pm \mathrm{标}\mathrm{准}\mathrm{偏}\mathrm{差}（\mathrm{S}\mathrm{D}） $，通过t检验或单向方差分析（两两比较采用最小二乘法）用于比较组间差异。P < 0.05被认为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 在肺癌组织中miR-196b高表达，ERG低表达
为预测肺腺癌中的差异表达基因，基于TCGA-LUAD进行差异分析。肺腺癌的miRNA表达量数据和临床数据分析结果显示，miR-196b在肺腺癌组织中表达升高[癌旁样本中的相对表达为（4.422±1.045），肿瘤样本中的相对表达为（6.317±2.468）]，见图1A。以miR-196b表达的中位值为界线将LUAD患者分为miR-196b高表达组和miR-196b低表达组，K-M（Kaplan-Meier）曲线分析发现miR-196b高表达患者的5 a生存率低于miR-196b低表达患者（P =
0.0016 ），说明miR-196b高表达与患者的生存率呈负相关，见图1B。在得到以上的研究结果后，笔者想进一步了解miR-196b的调控机制。基于TCGA数据库结合文献[24]确定研究对象ERG，发现ERG在肺腺癌组织中下调[癌旁样本中的相对表达为（11.544±0.606），肿瘤样本中的相对表达为（9.300±0.844），P = 3.50e-17]，见图1C。
图 1 miR-196b和ERG在肺腺癌中的表达情况A：通过TCGA数据库预测miR-196b在正常组织和肺腺癌组织中的表达，绿框图表示正常样本（n = 46），红框图表示肿瘤样本（n = 521）；B：肺腺癌患者miR-196b表达水平与总生存率的K-M分析，红色表示高表达组，蓝色表示低表达组；C：通过TCGA数据库预测正常组织和肺腺癌组织中ERG的表达，绿框图表示正常样本（n = 59），红框图表示肿瘤样本（n = 535）。Figure 1. Expression of miR-196b and ERG in lung adenocarcinoma2.2 miR-196b在肺腺癌细胞中高表达
基于以上生信结果，在细胞实验中进一步检测miR-196b表达量。结果显示，与BEAS-2B细胞（1±0.08）相比，miR-196b在HCC-78、PC-9、H1395、Calu-3细胞系中的表达均升高[分别为（4.55±0.23），（2.07±0.18），（3.14±0.22）和（2.54±0.18），（P < 0.05）]。且在HCC-78中升高的最多，见 图2，在后续分析中选用HCC-78细胞系做相关的实验。
图 2 miR-196b在肺腺癌细胞中的表达情况与BEAS-2B组比较，*P < 0.05。Figure 2. Expression of miR-196b in lung adenocarcinoma cells2.3 miR-196b可影响肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭
对miR-196b进行过表达和敲低处理（miR-mimic，miR-inhibitor），同时设置对照组（NC- mimic，NC-inhibitor）以研究miR-196b对LUAD进展的影响。过表达处理后的细胞系中miR-196b的表达量（22.71±1.19）较对照组（1±0.07）上调（P < 0.05），过表达效率为22倍；而敲低处理后的细胞系中miR-196b的表达量（0.25±0.03）较对照组表达水平（1±0.07）下调（ P < 0.05），达到75 %的沉默效率（ P < 0.05），见 图3A。说明转染结果良好，可以用于后续的实验。
图 3 miR-196b可影响肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭A：qRT-PCR检测过表达或敲低miR-196b后细胞的转染效率；B：MTT法检测过表达或敲低miR-196b后细胞的增殖能力；C：划痕愈合实验检测过表达或敲低miR-196b后细胞的迁移能力；D：Transwell实验检测过表达或敲低miR-196b后细胞的迁移和侵袭能力（100×）。与NC组比较，*P < 0.05。Figure 3. miR-196b can affect the proliferation，migration and invasion of lung adenocarcinoma cells为了探究转染处理后细胞增殖能力的变化情况，利用MTT实验进行检测，结果显示过表达处理组[72 h时光密度值为（1.687±0.123）]与对照组[72 h时光密度值为（1.245±0.108）]相比增殖能力上调，而敲低处理组[72 h光密度值为（0.925±0.094）]的增殖能力与对照组[72 h光密度值为（1.245±0.108）]相比下调，差异具有统计学意义（P < 0.05），见 图3B。
划痕愈合实验和Transwell实验结果表明过表达处理后的细胞系迁移和侵袭能力[划痕愈合率为（35.57±2.08），迁移细胞个数为（314±27），侵袭细胞个数为（288±21）]与对照组[划痕愈合率为（20.94±1.73），迁移细胞个数为（201±16），侵袭细胞个数为（166±11）]相比增强，差异具有统计学意义（P < 0.05），而敲低处理后细胞系迁移和侵袭能力[划痕愈合率为（18.13±1.61），迁移细胞个数为（179±14），侵袭细胞个数为（106±9）]与对照组[划痕愈合率为（43.64±2.51），迁移细胞个数为（298±21），侵袭细胞个数为（249±12）]相比减弱，差异具有统计学意义（ P < 0.05），见 图3C～3D。
2.4 ERG是miR-196b的靶基因
笔者搜索TargetScan数据库发现，ERG 3′-UTR与miR-196b有一段互补序列，见图4A，推测ERG是miR-196b的潜在靶基因。双荧光素酶实验结果显示，miR-mimic降低了转染ERG 3′-UTR WT的细胞的荧光素酶活性，但不能降低转染 ERG 3′-UTR MUT的细胞的荧光素酶活性，见图4B。这说明miR-196b与ERG之间存在物理上的相互作用，即miR-196b能靶向结合ERG。
图 4 miR-196b的靶点检测及不同处理组细胞中ERG 的表达情况A：通过TargetScan数据库预测miR-196b和ERG的靶向结合位点；B：双荧光素酶法检测miR-196b与ERG的靶向结合关系；C：采用qRT-PCR和Western blot检测各细胞系中ERG mRNA和蛋白的表达；D：采用qRT-PCR和Western blot检测不同处理组ERG mRNA和蛋白的表达。与NC组或BEAS-2B组做比较，*P < 0.05。Figure 4. Target detection of miR-196b and expression of ERG in cells of different treatment groups然后探究了ERG在各个细胞系的表达情况，结果显示，ERG的mRNA和蛋白表达水平在肺腺癌细胞系中下调[BSEA-2B细胞的ERG相对mRNA表达水平是（1±0.09），HCC-78、PC-9、H1395、Calu-3细胞系中ERG的mRNA表达水平分别为（0.31±0.02），（0.72±0.04），（0.83±0.06）和（0.51±0.03），（P < 0.05）]，且在HCC-78中表达最低，见 图4C。此外，为验证ERG和miR-196b功能上的关系，通过qRT-PCR和Western blot检测miR-196b在HCC-78细胞中过表达后ERG的mRNA和蛋白表达量，结果发现miR-196b过表达组中ERG的mRNA表达量（0.35±0.03）较对照组（1±0.11）下调，蛋白表达也呈降低趋势，差异具有统计学意义（P < 0.05），见 图4D。
2.5 miR-196b能靶向下调ERG促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力
为验证miR-196b是否通过靶向ERG在LUAD进展中发挥作用。构建单独过表达/沉默miR-196b，同时过表达miR-196b和ERG，同时沉默miR-196b和ERG的LUAD细胞系HCC-78，并通过qRT-PCR和Western blot检测转染效果。结果显示单独过表达miR-196b时，ERG的mRNA和蛋白表达量下调（P < 0.05），而miR-196b与ERG同时进行过表达处理时，ERG的mRNA和蛋白表达量较单独过表达miR-196b时上升（ P < 0.05）。单独沉默miR-196b时，ERG的mRNA和蛋白表达量得到了升高（ P < 0.05），而miR-196b与ERG同时沉默处理时，ERG的mRNA和蛋白表达量较单独沉默miR-196b时下降（ P < 0.05），见 图5A。接下来，利用MTT、划痕愈合和Transwell实验对不同处理组细胞增殖、迁移和侵袭能力进行检测。结果显示，单独过表达miR-196b的处理组细胞系增殖、迁移和侵袭能力较对照组增强，而同时过表达miR-196b与ERG的处理组细胞增殖、迁移和侵袭能力又得到了恢复。单独沉默miR-196b的处理组细胞系增殖、迁移和侵袭能力较对照组下降（P < 0.05），而同时沉默miR-196b与ERG的处理组细胞增殖、迁移和侵袭能力又得到了恢复，见 图5B～图5D。
图 5 miR-196b能靶向下调ERG促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力A：采用qRT-PCR和Western blot检测不同处理组大鼠ERG mRNA和蛋白的表达；B：MTT实验检测不同处理组的细胞增殖能力；C：划痕愈合实验检测不同处理组细胞迁移能力；D：Transwell实验检测不同处理组细胞的迁移和侵袭能力（100×）。NC-mimic、NC-inhibitor、oe-NC和si-NC分别表示miR-196b过表达、miR-196b沉默、ERG过表达和ERG沉默对照组，miR-mimic和miR-inhibitor分别表示miR-196b过表达和沉默组，oe-ERG和si-ERG分别表示ERG过表达组和沉默组；miR-mimic/inhibitor + oe/si-NC与NC组比较，miR-mimic/inhibitor + oe/si-NC组与miR-mimic/inhibitor + oe/si-ERG组比较，*P < 0.05，。Figure 5. miR-196b can target down regulate ERG to promote the proliferation，migration and invasion of lung adenocarcinoma cells3. 讨论
miRNA基于调节肿瘤相关基因表达的能力，在调节肿瘤特性中起着关键作用[25]。miR-196b在癌症中发挥双重作用，研究报道miR-196b低表达在胃癌[7]，白血病[26]中具有肿瘤抑制作用。最新研究表明，在头颈部鳞状细胞癌中miR-196b高表达与不良预后相关[27]。这些发现表明，miR-196b有作为肿瘤治疗靶点的潜力。在肺腺癌中，miR-196b已被发现能够通过靶向AQP4[8]促进肺腺癌的增殖和迁移。结合前人的研究，miR-196b可能通过靶向多个基因发挥作用，其对LUAD的影响机制还需继续探究。研究结果显示，与正常对照相比，miR-196b在肺腺癌中的表达水平上调，过表达miR-196b能够增强LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭能力，这与前人的研究一致，敲低miR-196b后则可明显抑制LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本研究进一步表明miR-196b在LUAD中可能充当肿瘤促进因子。
为了阐明miR-196b参与LUAD发病机制，笔者分析了受miR-196b调控的靶基因，利用TargetScan数据库搜索 miR-196b靶基因，并选择ERG为进一步研究的候选者。ERG于1987年发现，是E-26家族的成员，对整个组织和细胞的生长发育至关重要[28]。ERG是一种著名的致癌基因，人们发现在前列腺癌中，ERG的高表达与患者临床特征（晚期肿瘤分期、发生远端转移等）[29-30]和促进细胞行为（增殖、迁移和侵袭）[12, 31]有关。还有研究发现ERG的过表达能够促进肝细胞癌的血管生成[32]，下调ERG的表达可抑制肝癌细胞增殖，促进凋亡[14]。在肺腺癌中，ERG可作为预测LUAD患者的预后标志物[33]。然而，ERG在肺腺癌中的具体调控作用仍然不能确定。本研究发现ERG在肺腺癌中下调，miR-196b能够靶向抑制ERG的表达，过表达ERG回复过表达miR-196b对肺腺癌细胞增殖、迁移侵袭能力的促进作用。结果显示，miR-196b在LUAD中表现出明显的促癌作用，并可以被ERG过表达所逆转。但该结果与前列腺癌和肝细胞癌中的研究并不一致，笔者猜测这可能是因为肿瘤存在异质性造成的。LUAD细胞由于其分化特征与肝细胞、前列腺细胞存在区别而导致基因对肿瘤细胞的生长存在不同的影响。早前也有研究报道TM4SF1等基因由于肿瘤异质性的存在导致其在不同癌种中表现出不同的作用，笔者猜测ERG在不同癌种中存在不同的表现也是因为类似原因[34-36]。笔者的研究创新性地发现miR-196b与ERG在LUAD中的靶向调节关系，并发现了ERG基因对LUAD细胞表性的影响与在其他癌种中的差异。表明miR-196b在LUAD中可能通过调节多个靶点发挥作用。这为miR-196b可能作为癌症治疗靶点提供依据。
但本研究仍存在不足之处，例如目前本研究仅限于体外实验，缺乏体内验证；验证的细胞生物学功能较少；对miR-196b-ERG调控轴的上下游因子缺乏进一步挖掘。在未来的工作中，将在此基础上，利用体内实验对本研究的结论进行验证；探究miR-196b/ERG调控轴对LUAD其他生物学功能的影响；同时进一步探索miR-196b/ERG调控轴的上下游因子，完善LUAD发生发展的分子调控网络。总而言之，笔者目前的研究表明，miR-196b在LUAD中上调，并且能通过靶向下调ERG的表达来促进肺腺癌的增殖、迁移和侵袭，该研究为探索miR-196b和ERG在癌症中的功能提供了重要见解。
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图 1 miR-196b和ERG在肺腺癌中的表达情况
A：通过TCGA数据库预测miR-196b在正常组织和肺腺癌组织中的表达，绿框图表示正常样本（n = 46），红框图表示肿瘤样本（n = 521）；B：肺腺癌患者miR-196b表达水平与总生存率的K-M分析，红色表示高表达组，蓝色表示低表达组；C：通过TCGA数据库预测正常组织和肺腺癌组织中ERG的表达，绿框图表示正常样本（n = 59），红框图表示肿瘤样本（n = 535）。
Figure 1. Expression of miR-196b and ERG in lung adenocarcinoma
图 2 miR-196b在肺腺癌细胞中的表达情况
与BEAS-2B组比较，*P < 0.05。
Figure 2. Expression of miR-196b in lung adenocarcinoma cells
图 3 miR-196b可影响肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭
A：qRT-PCR检测过表达或敲低miR-196b后细胞的转染效率；B：MTT法检测过表达或敲低miR-196b后细胞的增殖能力；C：划痕愈合实验检测过表达或敲低miR-196b后细胞的迁移能力；D：Transwell实验检测过表达或敲低miR-196b后细胞的迁移和侵袭能力（100×）。与NC组比较，*P < 0.05。
Figure 3. miR-196b can affect the proliferation，migration and invasion of lung adenocarcinoma cells
图 4 miR-196b的靶点检测及不同处理组细胞中ERG 的表达情况
A：通过TargetScan数据库预测miR-196b和ERG的靶向结合位点；B：双荧光素酶法检测miR-196b与ERG的靶向结合关系；C：采用qRT-PCR和Western blot检测各细胞系中ERG mRNA和蛋白的表达；D：采用qRT-PCR和Western blot检测不同处理组ERG mRNA和蛋白的表达。与NC组或BEAS-2B组做比较，*P < 0.05。
Figure 4. Target detection of miR-196b and expression of ERG in cells of different treatment groups
图 5 miR-196b能靶向下调ERG促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力
A：采用qRT-PCR和Western blot检测不同处理组大鼠ERG mRNA和蛋白的表达；B：MTT实验检测不同处理组的细胞增殖能力；C：划痕愈合实验检测不同处理组细胞迁移能力；D：Transwell实验检测不同处理组细胞的迁移和侵袭能力（100×）。NC-mimic、NC-inhibitor、oe-NC和si-NC分别表示miR-196b过表达、miR-196b沉默、ERG过表达和ERG沉默对照组，miR-mimic和miR-inhibitor分别表示miR-196b过表达和沉默组，oe-ERG和si-ERG分别表示ERG过表达组和沉默组；miR-mimic/inhibitor + oe/si-NC与NC组比较，miR-mimic/inhibitor + oe/si-NC组与miR-mimic/inhibitor + oe/si-ERG组比较，*P < 0.05，。
Figure 5. miR-196b can target down regulate ERG to promote the proliferation，migration and invasion of lung adenocarcinoma cells
表 1 研究使用的细胞系及培养基
Table 1. Cell lines and media used in the study
细胞系 编号 培养基 BEAS-2B BNCC338205 DMEM-H PC-9 BNCC340767 HCC-78 BNCC338064 RPMI-1640 H1395 BNCC255519 Calu-3 BNCC338514 
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表 2 引物序列表
Table 2. Primer Sequence Table
基因 引物序列（5′→ 3′） miR-196b Forward primer: GTACCACTTTATCCCGTTCACCA
Reverse primer:ATCTCGAGGCAGGGAGAGAGGAATAAU6 Forward primer: GCCCATCTTGACCCGAAT Reverse primer: AACGCTTCACGAATTTGCGT ERG Forward primer:GAGTGGGCGGTGAAAGAATA Reverse primer: GGAGATGTGAGAGAAGAGTG GAPDH Forward primer:CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC Reverse primer:CCCAATACGACCAAATCCGTT
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