Mutation Analysis of OprD Gene in Pseudomonas Aeruginosa with Car-R/ Ceph-S
-
摘要:
目的 研究对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感（carbapenem-resistant but cephalosporin-susceptible ，Car-R/Ceph-S）的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中OprD基因的突变类型。 方法 对2021年1月至2021年3月昆明医科大学第一附属医院临床分离的10株对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感的铜绿假单胞菌进行分离培养；使用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测该表型铜绿假单胞菌中OprD基因的携带情况，并测序分析OprD基因的突变类型。 结果 10株菌株均显示出明显的OprD扩增条带，测序分析显示有以下突变类型，分别是移码突变2株、氨基酸替代突变8株、提前终止密码子2株、大片段缺失4株。 结论 对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感（Car-R/Ceph-S）的铜绿假单胞菌中OprD基因的突变类型呈多样化，点突变频率最高，还有大片段的缺失以及提前终止密码子。这些突变导致OprD结构发生改变，从而使得耐药现象的发生。 Abstract:Objective To study the mutation types of OprD gene in Pseudomonas aeruginosa resistant to carbapenems but sensitive to cephalosporins （Car-R/Ceph-S）. Methods Ten strains of Pseudomonas aeruginosa which were resistant to carbapenems but sensitive to cephalosporins were isolated and cultured in the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January 2021 to March 2021. Polymerase chain reaction （PCR） was used to detect the carrying status of OprD gene in Pseudomonas aeruginosa, and the mutation type of OprD gene was analyzed by sequencing. Results All the 10 strains showed obvious OprD bands and the sequencing analysis showed that there were 2 frameshift mutations, 8 amino acid substitutions, 2 early termination codons and 4 large fragment deletions. Conclusion The mutation types of OprD gene in carbapenem-resistant but cephalosporin-sensitive （Car-R/Ceph-S） strains of Pseudomonas aeruginosa are diversified with the highest frequency of point mutations, deletion of large segments and early termination of codons. These mutations lead to changes in the structure of OprD, resulting in the occurrence of drug resistance. -
Key words:
- Pseudomonas aeruginosa /
- Carbapenem resistance /
- Cephalosporin sensitivity /
- OprD /
- Gene mutation /
- Sequencing
-
铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是一种适应性很强的非发酵革兰阴性细菌，能够引起肺部感染、泌尿系统感染、烧伤创面感染等 [1]。其耐药机制复杂，对多种抗菌药物具有固有耐药性，从而使得可选择用于治疗相关感染的抗生素减少[2]。碳青霉烯类抗菌药物在治疗由铜绿假单胞菌引起的感染中起着重要作用[3]。但如今在中国的医院中铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物有着较高的耐药率，2019年CHINET三级医院细菌耐药监测显示铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别是27.5%和23.5%[4]。导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的机制复杂，以往的研究报道[5] OprD基因的突变、插入和/或缺失是导致碳青霉烯类抗菌药物耐药的常见机制。本研究对铜绿假单胞菌中一种少见的耐药表型：对碳青霉烯类耐药而对头孢菌素敏感（Car-R/Ceph-S）的铜绿假单胞菌的OprD基因序列进行分析，进而对OprD基因突变情况进行研究和探讨。
1. 材料与方法
1.1 样本来源
样本收集来自2021年1月至2021年3月昆明医科大学第一附属医院不同住院患者的痰、引流液、分泌物等标本分离的非重复菌株10株。经质谱仪（德国布鲁克公司）鉴定均为铜绿假单胞菌。经Vitek 2 Compact药敏鉴定系统及配套的GN09药敏板卡检测为美罗培南、亚胺培南耐药，头孢他啶和头孢吡肟敏感的分离株10株，分别标记为P1至P10。将菌株分离培养后用灭菌的牛奶冻存管冻存。
1.2 主要仪器及试剂
Vitek 2 Compact药敏鉴定系统以及配套试剂GN09药敏板卡购自法国生物梅里埃公司、MH琼脂平板购自郑州安图生物有限公司、哥伦比亚血琼脂平板购自郑州安图生物有限公司、药敏纸片购自英国OXOID公司、电泳仪购自北京六一生物科技有限公司、DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司、质谱仪购自德国布鲁克公司、PCR仪购自西安天隆科技公司、PCR试剂购自北京宝日医生物技术有限公司、凝胶成像仪购自通用电气（中国）医疗集团公司。
1.3 药敏试验
采用Vitek 2 Compact自动仪器法和纸片扩散法进行试验。抗生素包括头孢他啶、亚胺培南、头孢吡肟、美罗培南、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星。根据美国临床和实验室标准化委员会（CLSI）2020年的折点对结果进行判读[6]。以铜绿假单胞菌ATCC 27853为质控菌株。
1.4 OprD基因扩增
将冻存的菌株复融后用哥伦比亚血平板转种备用。严格按照试剂盒厂家说明书提取细菌DNA。根据相关文献[7]设计引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成：OprD-R：5＇-GTCGATTACAGGATCGACAG-3＇；OprD-F：5＇-CGCCGACAAGAAGAACTAGC-3＇，片段大小为1412 bp。
聚合酶链反应扩增 PCR反应体系：50 μL。其中，Emerald Amp MAX PCR Master Mix（2×Premix）25 μL，引物OprD-F、OprD-R各2 μL，无菌水16 μL，DNA模板5 μL。PCR反应条件：（1）预变性：95×5 min；（2）循环：95 ℃×30 min，61 ℃×30 min，72 ℃×90 min，共30个循环；（3）延伸：72 ℃×10 min；（4）4 ℃保存。产物电泳：用2%琼脂糖凝胶电泳，电压120 V，电泳时间20 min。最后在凝胶成像系统上观察结果并保存图片。
1.5 PCR产物测序
将获得的PCR扩增产物送北京擎科生物技术有限公司进行Sanger测序分析，并用DNAstar序列分析软件将核苷酸序列翻译成氨基酸链，再与铜绿假单胞菌PAO1菌株的OprD蛋白序列作比对分析。
2. 结果
2.1 Car-R/Ceph-S铜绿假单胞菌的耐药特点
10株受试菌株对亚胺培南和美罗培南均表现为耐药，对头孢他啶、头孢吡肟和阿米卡星均表现为敏感。未发现对哌拉西林和哌拉西林/他唑巴坦耐药的菌株，10株菌株对哌拉西林中介率为20%（2/10），对哌拉西林/他唑巴坦中介率为10%（1/10）；对其余抗菌药物的耐药率分别为：左氧氟沙星60%（6/10）、环丙沙星70%（7/10）、氨曲南30%（3/10）、庆大霉素10%（1/10）、妥布霉素20%（2/10）。PA对各种抗生素的耐药率，见表1。
表 1 PA对12种抗生素的耐药率（n=10）Table 1. Resistance rate of PA to 12 antibiotics （n=10）抗菌药物 敏感 中介 耐药 株数 敏感率（%） 株数 中介率（%） 株数 耐药率（%） 头孢他啶 10 100 0 0 0 0 头孢吡肟 10 100 0 0 0 0 亚胺培南 0 0 0 0 10 100 美罗培南 0 0 0 0 10 100 哌拉西林 8 80 2 20 0 0 哌拉西林/他唑巴坦 9 90 1 10 0 0 阿米卡星 10 100 0 0 0 0 庆大霉素 8 80 1 10 1 10 妥布霉素 8 80 0 0 2 20 环丙沙星 3 30 0 0 7 70 左氧氟沙星 3 30 1 10 6 60 氨曲南 1 10 6 60 3 30 2.2 PCR产物电泳
对10株菌株PCR产物电泳显示，所有菌株均出现明显的OprD条带，10株菌株中有6株OprD的条带在1 500 bp左右；而有4株（P5、P6、P8、和P10）的OprD电泳条带大概在1 000 bp左右，推测这4株菌株可能存在大片段的缺失。10株菌株电泳条带，见图1。
图 1 10株铜绿假单胞菌OprD的扩增条带M：Marker；P1～P10分别表示10株菌株OprD的扩增条带。Figure 1. Amplified bands of OprD of 10 Pseudomonas aeruginosa strains2.3 测序分析
10株菌株经测序后与标准菌株PAO1的序列比较分析后显示有不同的突变类型：有2株菌株（P1和P2）因碱基缺失导致移码突变；4株菌株（P5、P6、P8和P10）有大片段缺失，均为466～830位点大片段缺失；2株菌株（P3和P9）提前出现终止密码子。10株菌株的具体突变类型及突变特征，见表2。
表 2 10株铜绿假单胞菌OprD基因突变分析Table 2. Analysis of OprD gene mutation in 10 strains of Pseudomonas aeruginosa菌株 突变类型 突变特征 P1 移码突变 533位点缺失1个碱基（C） P2 移码突变 175-176位点缺失2个碱基（AG） P3 氨基酸替代、提前终止密码子 D43N S57E S59R
193-195位点TGG→TGAP4 氨基酸替代 T103S K115T F170L E185Q P186G V189T Q310E A315G G425A P5 氨基酸替代、大片段缺失 S57E S59R V127L
466-830位点大片段缺失P6 氨基酸替代、大片段缺失 S57E S59R V127L
466-830位点大片段缺失P7 氨基酸替代、小片段缺失 D43N S57E S59R E202Q I210A E230K S240T N262T
A267S A281G K296Q R310G V359L
1116-1118位点缺1个氨基酸（GTC）P8 氨基酸替代、大片段缺失 S57E S59R V127L
466-830位点大片段缺失P9 氨基酸替代、提前终止密码子 T103S K115T F170L E185Q P186G R310E A315G
1249-1251位点TGG→TGAP10 氨基酸替代、大片段缺失 S57E S59R V127L
466-830位点大片段缺失3. 讨论
10株菌株药敏实验结果显示：除了对亚胺培南和美罗培南均表现为耐药，对头孢他啶、头孢吡肟均表现为敏感外，PA对其余抗生素耐药率为0%～70%，与2019年CHINET[5]所报道的耐药率4.6%～27.2%有较大差异，分析原因可能有以下2点：（1）本研究在选择菌株时有要求，必须是Car-R/Ceph-S的铜绿假单胞菌；（2）与参与本次研究的菌株数量少有关。这些可能原因需要在以后的研究中增加菌株数量予以验证。电泳结果显示10株菌株均有明显的OprD条带，未发现有OprD基因的完全缺失，这与李飞等[8]所报道的2.73%的缺失率有差异，可能是菌株数量少所致。
测序分析显示：在10株Car-R/Ceph-S的铜绿假单胞菌中OprD基因存在以下几种类型的突变模式：一种是点突变，导致过早出现终止密码子；第二种是移码突变，插入或缺失一个或多个核苷酸；最后一种是碱基片段的缺失。这与Lee JY等[9]的报道相似。以往的研究报道[10] OprD基因的替换、缺失、插入或突变等变化可改变OprD孔蛋白的构象或抑制其存在，并产生对碳青霉烯类抗生素的耐药性。Sherrard Laura J等[11]也证实了OprD基因常见的突变都是导致PA对碳青霉烯类抗生素耐药的重要因素。本研究中所有试验菌株均对亚胺培南和美罗培南耐药，对所有试验菌株的OprD基因序列分析显示：试验菌株的OprD基因中有碱基的缺失或突变，导致OprD基因中出现移码突变或终止密码子的提前出现，这与Hirabayashi等[12]的研究一致。P4菌株的OprD基因序列中有9个氨基酸替代（T103S K115T F170L E185Q P186G V189T Q310E A315G G425A）与国内的研究[13-14]一致。与此外本研究也发现了一些新的氨基酸替代突变（D43N S57E S59R V127L V359L）。结合对10株Car-R/Ceph-S铜绿假单胞菌OprD基因的PCR扩增结果和测序分析，笔者发现有4株菌株（P5、P6、P8、P10）扩增后条带在1000 bp左右，测序后发现4株菌株均有466～830位点大片段缺失以及3个氨基酸替代（S57E S59R V127L）；所以，笔者推测466-830位点大片段缺失以及3个氨基酸的替代可能是导致该表型的2种重要突变，并且是同时发生的。在本研究中，有8株菌株OprD基因序列都有氨基酸的替代突变，笔者推测，这种类型的突变可能导致OprD孔蛋白的空间结构发生改变，从而导致耐药现象的出现。另外，有2株菌株（P3、P9）因突变使得终止密码子（TGA）的提前出现。有研究[9]显示：在OprD基因中过早出现终止密码子可以抑制OprD孔蛋白的存在，导致产生的OprD肽链异常缩短，OprD孔蛋白功能丧失。大量研究表明这也是导致铜绿假单胞菌对碳青霉烯类（主要是亚胺培南）耐药的重要原因。
综上所述，OprD基因在Car-R/Ceph-S的铜绿假单胞菌中起着重要作用；OprD基因的替换、缺失或插入突变等变化可改变OprD孔蛋白的构象或抑制其存在，并产生对碳青霉烯类抗生素的耐药性。本研究发现在Car-R/Ceph-S的铜绿假单胞菌中，OprD基因存在不同类型的突变，其中466～830位点大片段缺失以及3个氨基酸（S57E S59R V127L）的替代这两种同时出现的突变类型是有较大价值的，由于本次研究的菌株数量少，尚需进一步以大数量样本研究予以验证以及开展深入的耐药机制研究。此外，关于该特殊耐药表型的铜绿假单胞菌方面的研究较少，本研究结果可为此类型的研究提供参考。
-
图 1 10株铜绿假单胞菌OprD的扩增条带
M：Marker；P1～P10分别表示10株菌株OprD的扩增条带。
Figure 1. Amplified bands of OprD of 10 Pseudomonas aeruginosa strains
表 1 PA对12种抗生素的耐药率（n=10）
Table 1. Resistance rate of PA to 12 antibiotics （n=10）
抗菌药物 敏感 中介 耐药 株数 敏感率（%） 株数 中介率（%） 株数 耐药率（%） 头孢他啶 10 100 0 0 0 0 头孢吡肟 10 100 0 0 0 0 亚胺培南 0 0 0 0 10 100 美罗培南 0 0 0 0 10 100 哌拉西林 8 80 2 20 0 0 哌拉西林/他唑巴坦 9 90 1 10 0 0 阿米卡星 10 100 0 0 0 0 庆大霉素 8 80 1 10 1 10 妥布霉素 8 80 0 0 2 20 环丙沙星 3 30 0 0 7 70 左氧氟沙星 3 30 1 10 6 60 氨曲南 1 10 6 60 3 30 
下载: 导出CSV
表 2 10株铜绿假单胞菌OprD基因突变分析
Table 2. Analysis of OprD gene mutation in 10 strains of Pseudomonas aeruginosa
菌株 突变类型 突变特征 P1 移码突变 533位点缺失1个碱基（C） P2 移码突变 175-176位点缺失2个碱基（AG） P3 氨基酸替代、提前终止密码子 D43N S57E S59R
193-195位点TGG→TGAP4 氨基酸替代 T103S K115T F170L E185Q P186G V189T Q310E A315G G425A P5 氨基酸替代、大片段缺失 S57E S59R V127L
466-830位点大片段缺失P6 氨基酸替代、大片段缺失 S57E S59R V127L
466-830位点大片段缺失P7 氨基酸替代、小片段缺失 D43N S57E S59R E202Q I210A E230K S240T N262T
A267S A281G K296Q R310G V359L
1116-1118位点缺1个氨基酸（GTC）P8 氨基酸替代、大片段缺失 S57E S59R V127L
466-830位点大片段缺失P9 氨基酸替代、提前终止密码子 T103S K115T F170L E185Q P186G R310E A315G
1249-1251位点TGG→TGAP10 氨基酸替代、大片段缺失 S57E S59R V127L
466-830位点大片段缺失
下载: 导出CSV
-
[1] 中华医学会呼吸病学分会感染学组. 铜绿假单胞菌下呼吸道感染诊治专家共识[J]. 中华结核和呼吸杂志,2014,37(1):9-15. doi: 10.3760/cma.j.issn.1001-0939.2014.01.005 [2] Lister P D,Wolter D J,Hanson N D. Antibacterial-resistant pseudomonas aeruginosa: Clinical impact and complex regulation of chromosomally encoded resistance mechanisms[J]. Clin Microbiol Rev,2009,22(4):582-610. doi: 10.1128/CMR.00040-09 [3] 李绪定. 碳青霉烯类治疗铜绿假单胞菌肺炎的临床效果分析[J]. 医学信息,2018,31(13):134-136. doi: 10.3969/j.issn.1006-1959.2018.13.039 [4] 胡付品,郭燕,朱德妹,等. 2019年CHINET三级医院细菌耐药监测[J]. 中国感染与化疗杂志,2020,20(3):233-243. doi: 10.16718/j.1009-7708.2020.03.001 [5] Campana E H,Xavier D E,Petrolini F V,et al. Carbapenem-resistant and cephalosporin-susceptible: A worrisome phenotype among Pseudomonas aeruginosa clinical isolates in Brazil[J]. Braz J Infect Dis,2017,21(1):57-62. doi: 10.1016/j.bjid.2016.10.008 [6] Clinical and laboratory standard institute.M100-S30 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: Thirtieth informational supplement[M]. Wayne PA: CLSI, 2020: 43-45. [7] 孙庆惠,杨白雪,巴兆粉,等. 铜绿假单胞菌亚胺培南中介菌株OprD基因分析[J]. 中国感染与化疗杂志,2017,17(2):177-181. [8] 李飞,李丽娟,梁德志,等. 耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药特征及其耐药机制的研究[J]. 分子诊断与治疗杂志,2019,11(2):101-106. doi: 10.3969/j.issn.1674-6929.2019.02.007 [9] Lee J Y,Ko K S. OprD mutations and inactivation,expression of efflux pumps and AmpC,and metallo-β-lactamases in carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from the republic of Korea[J]. Int J Antimicrob Agents,2012,40(2):168-172. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2012.04.004 [10] González-Vázquez M C,Rocha-Gracia RDC,Carabarín-Lima A,et al. Location of OprD porin in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates[J]. APMIS,2021,129(4):213-224. doi: 10.1111/apm.13118 [11] Sherrard Laura J,Wee Bryan A,Duplancic Christine,et al. Emergence and impact of oprD mutations in Pseudomonas aeruginosa strains in cystic fibrosis[J]. J Cyst Fibros,2022,21(1):e35-e43. doi: 10.1016/j.jcf.2021.03.007 [12] Hirabayashi A,Kato D,Tomita Y,et al. Risk factors for and role of OprD protein in increasing minimal inhibitory concentrations of carbapenems in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa[J]. J Med Microbiol,2017,66(11):1562-1572. doi: 10.1099/jmm.0.000601 [13] 陈丹娜,李飞,李丽娟,等. 东莞地区耐亚胺培南铜绿假单胞菌oprD基因分析[J]. 河北医学,2019,25(5):866-871. doi: 10.3969/j.issn.1006-6233.2019.05.39 [14] 席红利,李娟,杨丽娜,等. 耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性特征及oprD基因突变分析[J]. 基因组学与应用生物学,2019,38(12):5684-5688. -
下载:
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 3368
- HTML全文浏览量: 2153
- PDF下载量: 25
- 被引次数: 0
