Effect of miR-29c-3p/IGF1 Molecular Axis on Activation，Proliferation and Apoptosis of Hepatic Stellate Cells
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摘要:
目的 探讨miR-29c-3p通过IGF-1对肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化，增殖和凋亡的影响。 方法 原代培养小鼠HSCs，并通过免疫荧光检测HSCs标志物ɑ-SMA表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-29c-3p和IGF-1的靶向关系。TGF-β激活HSCs，并且外源性调控miR-29c-3p和IGF-1的表达水平后，分别采用Westernbolt，CCK-8，克隆形成实验和流式细胞术检测活化HSCs中活化相关蛋白（ɑ-SMA，DDR2，FN1，ITGB1和GFAP）的表达，增殖，克隆形成数和凋亡。 结果 ɑ-SMA阳性表达表明成功分离小鼠HSCs。miR-29c-3p mimic可降低野生型IGF-1的荧光素酶活性，但是对突变型IGF-1没有影响。过表达miR-29c-3p和低表达IGF-1能减少ɑ-SMA，DDR2，FN1和ITGB1表达，增加GFAP的表达，并且降低HSCs的增殖活力和克隆形成数，上调其凋亡比例。 结论 miR-29c-3p通过靶向抑制IGF-1表达，进而抑制HSCs活化和增殖，并促进其凋亡。 Abstract:Objective To investigate the effects of miR-29c-3p on the activation, proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells （HSCs） via IGF-1. Methods Primary mouse HSCs were cultured and the expression of HSCs marker ɑ-SMA was detected by immunofluorescence. By dual-luciferase reporter gene assay was conducted to Validate the Targeting Relationship between miR-29c-3p and IGF-1. After TGF-β activation of HSCs and exogenous regulation of miR-29c-3p and IGF-1 expression, the expression of activation-related proteins （ɑ-SMA, DDR2, FN1, ITGB1 and GFAP）, proliferation, colony-forming number and apoptosis in activated HSCs were detected by Western bolt, CCK-8, colony-forming unit assays and flow cytometry, respectively. Results Positive expression of ɑ-SMA indicated that the successful isolation of mouse HSCs. miR-29c-3p significantly reduced the luciferase activity of wild-type IGF-1, but had no effect on mutant IGF-1. Over-expression of miR-29c-3p and hypo-expression of IGF-1 significantly decreased ɑ-SMA, DDR2, FN1 and ITGB1 expression, increased GFAP expression, and decreased proliferation viability and colony-forming number of HSCs and upregulated their apoptotic ratio. Conclusion miR-29c-3p inhibits the activation and proliferation of HSCs and promotes their apoptosis by targeting IGF-1 expression. -
Key words:
- Alcoholic liver disease /
- Hepatic stellate cells /
- Activation /
- Proliferation /
- Apoptosis /
- miR-29c-3p /
- IGF-1
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肝内胆管癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤[1]，预后差，近年来，其发病率逐年升高[2]。腺苷酸激酶4（Adenylate kinase4，AK4）是腺苷酸激酶家族的一员，其分子量为25kDa，别称为AK3L1。多项研究显示AK4促进恶性肿瘤的发生发展[3-5]。但其对肝内胆管癌的作用尚无报道。本实验通过小干扰RNA手段，就AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移能力的影响作出探究。
1. 资料与方法
1.1 细胞系
本实验所用肝内胆管癌细胞HUCCT1购自上海誉驰生物科技有限公司，该细胞已通过中国科学院昆明动物研究所鉴定明确。该细胞作为肝内胆管癌细胞株之一，常用于肿瘤增殖、迁移的研究。
1.2 小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）转染细胞
本实验采用siRNA技术以沉默AK4。siRNA购自上海市吉玛基因生物技术有限公司，共计构建6条si-RNA序列，序列设计见表1。本次实验分组为空白对照组（CON）、阴性对照组（siRNA-NC）、阳性对照组（siRNA-GAPDH）、实验组1（siRNA-AK4-1），实验组2（siRNA-AK4-2），实验组3（siRNA-AK4-3）。转染试剂采用上海市吉玛基因生物技术有限公司GP-transfect-Mate。采用免疫印迹法（Western Blot，WB）对实验组1、实验组 实验组3进行si-RNA筛选，其中空白对照组不添加siRNA，阴性对照组基因序列与目的基因序列无同源性，阳性对照组基因序列与内参GAPDH同源。各组间其余实验操作步骤（转染方法、WB、EdU、细胞划痕实验）均一致。
表 1 si-RNA序列Table 1. Sequence of si-RNA built by siRNA technology组别 序列 Antisense Negative control 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ GAPDH Positive control 5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′ 5′-AACCAUGUAGUUGAGGUCATT-3′ siRNA-AK4-1 5′-GCGGAAGGGUAUAUAACCUTT-3′ 5′-AGGUUAUAUACCCUUCCGCCT-3′ siRNA-AK4-2 5′-CAGGCUAAGACAGUACAAATT-3′ 5′-UUUGUACUGUCUUAGCCUGTT-3′ siRNA-AK4-3 5′-CACCUAUUCAGUCCAAAGATT-3′ 5′-UCUUUGGACUGAAUAGGUGTT-3′ 转染前1 d将HUCCT1细胞接种至6孔板中，以次日细胞融合度达到60%～80%为宜，用无抗生素的完全培养基进行培养。转染：（1）转染试剂室温备用；（2）按照每孔200 µL无血清培养基（1640培养基）加5～8 µL转染试剂配置转染试剂混合物。静置5 min；（3）按照每孔200 µL无血清培养基（1640培养基）加150/pmol siRNA配置siRNA混合物。静置5 min；（4）将转染试剂混合物滴加到siRNA混合物中，混匀，静置20 min；（5）20 min后将混合液均匀加至6孔板各孔中；（6）各孔另外加入1 600 µL无抗生素完全培养基；（7）孔板放入细胞培养箱中培养48 h，使用免疫印迹检测转染效率。
1.3 免疫印迹实验检测转染效率及siRNA筛选
（1）裂解细胞：使用PMSF（品牌：Beyotime，货号：ST506-2 PMSF）与RIPA裂解液（强）品牌：Beyotime，货号：P0013B）按照200∶1配置细胞裂解液。于冰上充分裂解细胞；（2）测蛋白浓度：取裂解产物于4 ℃离心机12000 r/min，离心30 min。吸取86 µL上清液，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（品牌：Beyotime，货号：P0012 500次）测定蛋白浓度；（3）取80 µL上清液加20 µL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（品牌：Beyotime，货号：P0015L）沸水加热15 min；（4）电泳：配置12%下层胶，5%上层胶，蛋白上样量为2.5 µg，上层胶60 V恒压电泳，下层胶100 V恒压电泳；（5）转膜：甲醇浸泡PVDF膜，胶、膜放置妥当后以300 mA恒流条件下湿转发转膜，时间为30 min；（6）封闭：PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭，缓慢摇晃，室温封闭2 h；（7）：孵育一抗：兔单克隆抗体[EPR7678] to AK3L1抗体，（1∶7000，品牌：Abcam，货号：ab131327）。一抗孵育过夜，4 ℃；（8）：孵育二抗：山羊抗兔IgG（H+L）（品牌：Proteintech，货号：SA00001-2，1∶10000），室温孵育2 h；（9）显影：ECL化学发光液孵育1 min后，于成像仪中曝光显影。
1.4 增殖EdU实验
（1）转染细胞：6孔板培养细胞。免疫印迹实验已明确siRNA-AK4-3的沉默效果最好，故本次实验使用siRNA-NC及siRNA-AK4-3做细胞转染。分组亦同。转染完成24 h开始进行EdU实验。（2）工作液孵育：使用BeyoclickTM Edu-555配置2XEdU工作液后（品牌：Beyotime，货号：C0075s），与无抗生素完全培养基等体积加入六孔板中，孵育2 h。（3）：固定、染色：每孔1 mL固定液固定15 min，洗涤后加入通透液孵育15 min，Click反应液孵育15 min，1X Hoechst 33342溶液孵育10 min。（4）：荧光检测：洗涤液清洗后于倒置荧光显微镜观察。
1.5 细胞划痕实验
（1）转染细胞：6孔板培养细胞。本次实验分组为siRNA-NC及siRNA-AK4-3。转染完成24 h开始细胞划痕实验。（2）画线：使用直尺于6孔板背面作横行画线。（3）划痕：待细胞融合度为95%～100%时，使用200 µL枪头沿直尺作垂直于画线的划痕。（4）冲洗：使用PBS冲洗孔板3次，动作轻柔，吸净PBS后，加入无血清1640培养液。（5）拍照：每孔以“十”字交叉处上下为定点，于0 h，12 h，24 h，36 h拍照，对比不同时间下各组细胞迁移能力，并进行统计分析。
1.6 统计学处理
数据分析使用GraphPad Prism 8及SPSS 26统计软件，计量资料采用（
$\bar x \pm s $ ），计数资料用t检验，3组及多组计量资料采用单因素方差分析。所有检验取两端。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 siRNA转染效率及筛选
免疫印迹法检测各组后量化结果分别为：空白对照组（CON）：（0.9±0.01，）阴性对照组（siRNA-NC）：（0.92±0.01），阳性对照组（siRNA-GAPDH）：（0.95±0.04），实验组1（siRNA-AK4-1）：（0.74±0.08），实验组2（siRNA-AK4-2）：（0.45±0.04），实验组3（siRNA-AK4-3）：（0.24±0.02）。免疫印迹结果显示各组内参齐，沉默效果较好，其中阳性对照组对GAPDH的沉默效果显著。各siRNA组中siRNA-AK4-3对AK4的沉默效果最好，见图1，2。因此，后期实验使用siRNA-NC作为对照组，siRNA-AK4-3作为实验组。
图 2 各组细胞中AK4蛋白的相对表达量siRNA-GAPDH组为阳性对照，取GAPDH/AK4。各组分别与siRNA-NC组比较，除CON组无统计学差异其余各组均有统计学差异。**P < 0.01，***P < 0.005，****P < 0.001。Figure 2. The relative expression level of AK4 protein in each group2.2 增殖EdU实验
Edu实验结果显示：siRNA-NC组增殖细胞（15.9±4.4）/视野，细胞总数（110.9±22.4）/视野。siRNA-AK4-3组增殖细胞数目（12.8±5.0）/视野，细胞总数（116.7±22.1）/视野。两组增殖比率有差异，差异有统计学意义。siRNA-NC组增殖细胞多于siRNA-AK4-3组，AK4促进细胞增殖，见图3，4。
图 3 EdU检测siRNA-NC与siRNA-AK4-3细胞的增殖情况（×200）Figure 3. The proliferation of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells was detected by EdU （×200）
图 4 siRNA-NC组与siRNA-AK4-3的细胞增殖比率*P < 0.05。Figure 4. The proliferation rate of siRNA-NC group and siRNA-AK4-3图3中EdU中增殖的HUCCT1细胞被标记为红色荧光，Hoechst 33342中蓝色荧光标记的为视野下所有活细胞，Merge图由EdU和Hoechst 33342图像合并后得到。
2.3 细胞划痕实验
划痕实验取划痕面积/视野总面积，各组面积比见表2，差异有统计学意义，见图5，6。siRNA-NC组细胞迁移面积较siRNA-AK4-3组更大，AK4促进细胞迁移。
表 2 划痕面积比Table 2. Scratch area ratio项目 0 h 12 h 24 h 36 h siRNA-NC 0.39 ± 0.01 0.26 ± 0.017 0.12 ± 0.017 0.08 ± 0.026 siRNA-AK4-3 0.39 ± 0.005 0.33 ± 0.001 0.24 ± 0.024 0.24 ± 0.027 
图 5 siRNA-NC与siRNA-AK4-3细胞划痕后面积变化，图中红色边缘为Image J软件勾勒Figure 5. The area changes of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells after scratches，and the red edge in the figure is outlined by Image J software
图 6 siRNA-NC组与siRNA-AK4-3组细胞划痕后面积占视野总面积比的变化*P < 0.05，**P < 0.01。Figure 6. In the siRNA-NC group and siRNA-AK4-3 group，ns represented no difference in the ratio of cell area to total field area after scratches3. 讨论
肝内胆管癌的手术治疗是极其重要的，目前全球范围内术后其平均无瘤生存时间（ DFS） 为12 ～ 36 个月[6-7]，但胆管癌起病隐匿，多数患者在发现疾病时已属晚期[8]，据报道，肝内胆管癌的根治切除率为30%～40% ，其他肝胆恶性肿瘤均比此数据高[1，9]。肝内胆管癌的辅助化疗（吉西他滨联合铂类）在一定程度上实现肿瘤将期，从而获得手术机会[10-12]，但其中位生存期仍然不到1 a时间[13-15]。根据Andrew X Zhu的RCT临床研究，靶向药物Ivosidenib使得患者有10.3个月的中位生存期，而安慰剂组仅有7.5个月[16]，Abou-Alfa GK等学者也通过RCT实验研究了Ivosidenib在胆管癌中的作用，其结果是实验组的无病生存期为2.7个月（95% CI：1.6～4.2），而安慰剂组的无病生存期为1.4个月（95% CI：1.4～1.6）[17]。A Demols也在胆管癌的靶向治疗上进行了RCT研究，他研究了靶向药Regorafenib对胆管癌作用，最终得出实验组无病生存期为3.0个月（95% CI：2.3～4.9），而对照组无病生存期为1.5个月（95% CI：1.2～2.0），然而实验组的总生存时间和对照组的总生存时间并无统计学差异[18]。可以看出，靶向药能提高患者生存时间，但有研究显示部分靶向药并不能显著提升患者的总生存率[18, 19]。因此需寻找一个更有效的作用靶点。
1944年，美国学者Kalckar在实验中首次发现了肌苷酸[20]。在随后的科学实践中，更名为腺苷酸激酶AK。AK4定位于细胞线粒体基质内，在肝脏、心脏、脑、肾脏、胃肠道组织中富于表达[21]，AK4在细胞能量代谢方面表现出特异性[22]，因此他与肿瘤应该存在相关性。2012年由台湾地区学者Yi-Hua Jan完成了首例AK4与癌症关系论证的研究：体外试验中shRNA沉默肺癌细胞CL1-5和A549中的AK4后，两株细胞的侵袭能力下降约50%，从而证实AK4促进肺癌细胞的侵袭[3]。连云港市的学者MinMin HUANG在研究中显示AK4在人浆液性卵巢癌组织中高表达。在体内试验中，AK4敲低组的肿瘤体积明显减小，肿瘤重量明显减轻。这些试验均显示AK4促进了人浆液性卵巢癌的发生发展[4]。Jie Zhang等在Her-2阳性乳腺癌中的研究显示AK4的表达水平与肿瘤TNM分期（P = 0∶017）和淋巴结转移（P = 0∶046） 显著相关。体外试验中，MTT法、细胞划痕实验和Transwell试验都显示敲低AK4组的癌细胞增值、迁移、侵袭能力减弱。体外试验也显示敲低了AK4的肿瘤组织体积减小，重量减轻[5]。此后AK4与肿瘤的研究未曾断绝，田华等学者通过免疫组化等方法证实了AK4在肺腺癌中高表达[23]。李辰运的研究显示AK4在胰腺导管腺癌中高表达，并且与肿瘤分期、淋巴结转移、神经受侵、脉管内瘤栓有相关性（P < 0.05）[24]。李绍军等也证实AK4在食管鳞状细胞中高表达[25]，夏林等也通过免疫组化的方式证实了AK4在胃癌中高表达[26]，尽管我国的多数学者都明确了AK4在大多数肿瘤中的表达，但是很遗憾，仅有少数人通过体内、体外实验论证AK4对相关癌症的影响，无法将他们的研究进一步转化为临床制定治疗方案的依据。
本实验首次论证AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移的影响。首先予siRNA沉默AK4的表达，再通过EdU检测细胞增殖能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力。本次实验的结论与前人的研究结论相似，即AK4促进肝内胆管癌细胞HUCCT1的增殖、迁移。本实验的不足在于，笔者尚未完成AK4对肝内胆管癌细胞其他生物学能力的影响，如EMT、侵袭等等。因此，笔者接下来即将完成其他细胞生物学行为实验，并且探究在机制方面的变化以及通过体内实验验证结论。本实验结论将为肝内胆管癌的临床分子靶向治疗提供基础实验数据，采用生物医学工程技术干预肝内胆管癌组织中AK4的表达，将有助于肿瘤的综合治疗。
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图 1 成功分离HSCs，并且miR-29c-3p在不同状态的HSCs中差异表达
A：采用IF检测HSCs标志物ɑ-SMA是否表达；B：TGF-β处理HSCs前后，WB检测活化相关蛋白（ɑ-SMA，DDR2，FN1，ITGB1和GFAP）的表达；C：在静息及激活状态HSCs中，miR-29c-3p的表达差异。**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 1. Successful isolation of HSCs and differential expression of miR-29c-3p in HSCs of different status.
图 2 miR-29c-3p抑制HSCs的活化和增殖，并促进其凋亡
A：采用RT-qPCR检测miR-29c-3p mimic的转染效率；B：通过WB检测miR-29c-3p对活化相关蛋白（ɑ-SMA，DDR2，FN1，ITGB1和GFAP）表达的影响；C：CCK-8试剂盒检测不同组别中TGF-β激活的HSCs增殖活力；D：克隆形成实验检测miR-29c-3p对活化HSCs的克隆形成数的影响；E：流式细胞术检测活化HSCs的凋亡比例。**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 2. miR-29c-3p inhibits the activation and proliferation of HSCs and promotes their apoptosis.
图 3 IGF-1是miR-29c-3p下游靶标mRNA
A：Starbase数据库预测得到的miR-29c-3p与IGF-1的潜在3’ UTR结合序列（上），并且突变IGF-1的3’ UTR结合序列后，双荧光素酶报告基因实验验证miR-29c-3p与IGF-1的靶向关系（下）；B：活化的HSCs中分别转染miR-29c-3p inhibitor和miR-29c-3p mimic，采用WB检测IGF-1的表达变化。**P < 0.01。
Figure 3. IGF-1 is a downstream target mRNA of miR-29c-3p.
图 4 miR-29c-3p通过IGF-1抑制HSCs的活化和增殖，并促进其凋亡
A： miR-29c-3p inhibior的转染效率；B：通过WB检测得到的sh-IGF-1的转染效率；C：不同组别HSCs中活化相关蛋白（ɑ-SMA，DDR2，FN1，ITGB1和GFAP）表达的表达变化；D：CCK-8实验检测活化的HSCs增殖活力；E：克隆形成实验得到的不同组别中活化HSCs的克隆形成数；F：流式细胞术检测活化HSCs的凋亡比例。与sh-NC组比较，aP < 0.05，aaP < 0.01，aaaP < 0.001；与sh-IGF-1组比较，bP < 0.05，bbP < 0.01，bbbP < 0.001；*P < 0.05，***P < 0.001。
Figure 4. miR-29c-3p inhibits the activation and proliferation of HSCs and promotes their apoptosis through IGF-1.
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