Whole Genome Analysis of Coxsackievirus A10 in Yunnan Province
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摘要:
目的 分析从2022年手足口病患儿粪便样品中分离到的柯萨奇病毒A组10型（coxsackievirus A10，CVA10）分离株的全基因组特征。 方法 经人横纹肌肉瘤细胞（human rhabdomyosarcoma，RD）分离得到该分离株，将其命名为155/YN/CHN/2022。提取病毒RNA，采用反转录聚合酶链反应 （reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增其VP1序列，鉴定血清型。然后分段全基组扩增并拼接155/YN/CHN/2022的全基因组序列，利用MEGA7.0、DNAStar7.1和Simplot3.5.1等软件对序列进行分析。 结果 CVA10分离株155/YN/CHN/2022经扩增及拼接后得到的全基因组序列长为7403 nt，其中5'UTR区为746 nt，3'UTR区为76 nt，编码区长6552 nt，该分离株与CVA10原型株的核苷酸序列和氨基酸序列一致性分别为78.43%和95.30%，而与其他国内外CVA10分离株的核苷酸序列和氨基酸序列一致性分别为91.18%～95.06%和97.63%～98.54%。系统发育分析发现，155/YN/CHN/2022位于C基因型。P1、P2、P3系统发育结果显示，在P2、P3非编码区，该分离株与其他血清型毒株可能发生过重组。Simplot重组分析也显示，CVA10分离株155/YN/CHN/2022可能在非编码区出现重组事件。 结论 CVA10分离株155/YN/CHN/2022属于C基因型，和近年来中国大陆流行株属于同一基因型。 -
关键词:
- 手足口病 /
- 柯萨奇病毒A组10型 /
- 全基因组 /
- 进化分析
Abstract:Objective To analyze the whole-genome characteristics of a coxsackievirus A10 （CVA10） isolate obtained from fecal samples of children with hand, foot, and mouth disease in 2022. Methods The isolate was obtained from human rhabdomyosarcoma （RD） cells and named 155/YN/CHN/2022. Viral RNA was extracted, and the VP1 sequence was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） to identify the serotype. The whole genome sequence of 155/YN/CHN/2022 was amplified and assembled. Sequence analyses were performed using software such as MEGA7.0, DNAStar7.1, and Simplot3.5.1. Results The complete genomic sequence of CVA10 isolate 155/YN/CHN/2022 was 7403 nt long, with a 746 nt 5'UTR region, a 76 nt 3'UTR region, and a 6551 nt coding region. The nucleotide and amino acid sequence identities of this isolate compared to the prototype strain of CVA10 were 78.43% and 95.30%, respectively, while the identities compared to other domestic and foreign CVA10 isolates ranged from 91.18% to 95.06% for nucleotide sequences and 97.63% to 98.54% for amino acid sequences. Phylogenetic analysis revealed that 155/YN/CHN/2022 belonged to the C genotype. Phylogenetic analyses of P1, P2, and P3 regions suggested this isolate may have undergone recombination with other serotype strains in the P2 and P3 non-coding regions. Simplot recombination analysis also indicated possible recombination events in the non-coding regions of P2 and P3 for CVA10 isolate 155/YN/CHN/2022. Conclusion CVA10 isolate 155/YN/CHN/2022 belongs to the genotype C, which is consistent with recent epidemic strains in mainland China. -
柯萨奇A组10型病毒（Coxsackievirus A10，CVA10）是属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）的重要人类病原体[1]。与其他肠道病毒类似，CVA10的基因组是一条长约7.4 kb的单链正义RNA分子[2]，包含一个开放阅读框，编码区编码一个多聚蛋白，该蛋白通过翻译后加工被切割成4个结构蛋白（VP1-VP4）和7个非结构蛋白（2A-2C和3A-3D），其中，VP1蛋白是主要的抗原决定簇[3−5]。CVA10是手足口病（hand，foot，and mouth disease，HFMD）的主要病原体之一，近年来，其在手足口病中的检出率较高，如2016—2018武汉地区的CVA10阳性率为8.4%[6]，2019—2023浙江省金华市的HFMD病原谱中CVA10占比4.56%[7]，2021—2022年昆明地区CVA10检出率为12.77%[8]，表明CVA10已成为近年来我国手足口病流行的主要病原之一。本研究对从2022年云南省手足口病患儿粪便中分离到的CVA10毒株的全基因组序列进行测序及分析，以期为CVA10的分子流行病学研究及相关疾病的防控提供参考数据。
1. 材料与方法
1.1 毒株来源
CVA10分离株155/YN/CHN/2022从2022年5月至7月的云南省昆明地区手足口病患儿临床样本中经RD细胞分离获得，保存于中国医学科学院医学生物学研究所。本实验已通过云南省昆明市妇幼保健院伦理委员会批准（2022-02-17）。
1.2 主要试剂
病毒RNA提取试剂盒（Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit）购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；RT-PCR试剂盒（PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2）购自大连宝生物工程有限公司；新生牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；DMEM基础培养基由中国医学科学院医学生物研究所中心供应室提供。
1.3 病毒型别鉴定
按照Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit试剂盒操作说明书提取病毒RNA。用PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2试剂盒对提取的病毒RNA进行RT-PCR，扩增部分VP1序列，引物使用肠道病毒通用引物AN88、AN89[9]。扩增产物送至擎科生物科技股份有限公司昆明分公司进行测序，测序结果用NCBI blast进行序列比对。
1.4 全基因组测序及拼接
设计CVA10全基因组扩增及测序引物（表1）。分段扩增CVA10分离株的全基因组，采用“引物移步法”进行测序，并用DNAStar7.1中的SeqMan进行序列拼接和组装。引物合成及测序均由擎科生物科技股份有限公司昆明分公司完成。
表 1 全基因组序列扩增及测序引物Table 1. Primers for whole genome sequence amplification and sequencing引物 序列（5'→3'） 核苷酸位置 方向 A-OAS GGRTANCCRTCRTARAACCAYTG 3109 –3089 反向引物 A-OS CCNTGGATHAGYAACCANCA 2268 –2287 正向引物 E201F TTAAAACAGCCTGTGGGTTG 1–20 正向引物 A10N1r GGGTTGCCCCATAGGCAG 812–795 反向引物 A10N1f GTAGCCACTGGAGGATCT 1052 -1069 正向引物 A10N2R CACAGCTTGTTGTGTCACTT 2511 -2493 反向引物 A10N3F CATGTATGTGCCCCCTGGCG 3261 –3280 正向引物 A10N4f CTTAGGCCGCTTAGATGC 3960 –3977 正向引物 A10N5r CCAAGGACACAATATGTC 6598 –6581 反向引物 A10N6f TTGGTTCCGAGGGAGCGG 7042 –7059 正向引物 A10N7f CTTGCCAGATCACCAATT 6046 –6063 正向引物 CA168R GGTTATAACAAATTTACCCCC 7404 –7385 反向引物 1.5 序列分析
在GenBank数据库中检索并下载其他CVA10参考株序列，用MEGA7.0软件的邻位相接法（neighbor-joining method，NJ）构建基于全基因组序列、VP1基因和P1、P2、P3区的系统进化树，Bootstrap 值设定为 1000replicate。用DNAStar7.1分析核苷酸和氨基酸序列一致性，用Simplot3.5.1软件进行重组分析。
2. 结 果
2.1 全基因组结构分析
经全基因组扩增、测序、序列拼接和比对后得到，155/YN/CHN/2022分离株为CVA10血清型，其基因组全长为
7403 nt，5'UTR区长为746 nt，3'UTR区长为76 nt，5'UTR区和3'UTR区之间的开放阅读框长为6552 nt，和其它CVA10参考株相比未见核苷酸插入与缺失，编码区编码一个含有2183aa的多聚蛋白。该毒株与CVA10原型株Kowalik的全基因组核苷酸和氨基酸序列一致性分别为78.43%和95.30%，与其他CVA10代表株的全基因组核苷酸序列一致性为91.18%～95.06%，氨基酸序列一致性为97.63%～98.54%（表2）。用NCBI blast工具对CVA10分离株的各个区段（5'UTR、VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D、3'UTR）分别进行序列比对（表3），结果显示，155/YN/CHN/2022分离株在P3区与CVA16毒株C138/CHW/AUS/2016相似性较高，为91.39%，在3D区与CVA16毒株CVA16/TH/MUMT-1/2016相似性最高，为97.12%，在3'UTR区与CVA16毒株V18-026相似性最高，为97.01%；而在其他基因区段，155/YN/CHN/2022分离株均与CVA10毒株的相似性最高。
表 2 CVA10分离株与其原型株、其他CVA10株核苷酸和氨基酸一致性比对Table 2. Nucleotide and amino acid sequence identity comparison of CVA10 isolate with prototype and other CVA10 strains in all sequenced genomic regions基因组
区域原型株 其他A10分离株 核苷酸
一致性（%）氨基酸
一致性（%）核苷酸
一致性（%）氨基酸
一致性（%）5'UTR 83.9～96.2 95.98～98.39 VP4 77.78 94.20 94.69～98.55 94.20～100 VP2 77.66 96.08 93.59～98.30 96.08～100 VP3 76.69 94.3～98.3 93.65～99.15 91.2～100 VP1 76.87 92.95 95.97～100 98.66～100 2A 81.33 95.33 94.22～99.11 92.67～99.33 2B 78.84 96.97 93.94～98.99 95.96～100 2C 83.50 96.05 94.33～98.89 99.39～99.7 3A 82.95 95.35 94.57～90.61 96.51～100 3B 90.91 100.00 93.94～98.48 89.3～96.8 3C 78.08 95.08 93.98～97.87 90.71～97.27 3D 83.08 95.24 90.70～97.12 95.89～97.84 3'UTR 93.83 93.42～97.01 Genome 78.43 95.30 91.18～95.06 97.63～98.54 表 3 155/YN/CHN/2022分离株与其他EVA病毒分离株之间的基因组不同区域的一致性比较Table 3. Consistency comparison of different genomic regions between 155/YN/CHN/2022 isolates and other EVA virus isolates基因区段 血清型 毒株 核苷酸同源性（%） 基因登陆号 5'UTR CVA10 PD19-80 98.39 MW929277.1 VP4 A10 144_GD/CHN_2021 98.55 PP078948.1 VP2 A10 GD/CHN_2021 98.30 PP078947.1 VP3 A10 GD/CHN_2021 99.15 PP078948.1 VP1 A10 A296-YN-CHN-2022 100.00 LC791297.1 2A A10 GD/CHN_2021 99.11 PP078948.1 2B A10 GD/CHN_2021 98.99 PP078948.1 2C A10 GD/CHN_2021 98.89 PP078948.1 3A A10 GD/CHN_2021 99.61 PP078948.1 3B A10 GD/CHN_2021 98.48 PP078948.1 3C A10 GD/CHN_2021 97.87 PP078948.1 3D A16 CVA16/TH/MUMT-1/2016 97.12 OM417116.1 3'UTR A16 V18-026 97.01 MH780757.1 Genome A10 GD/CHN_2021 95.06 PP078948.1 P1 A10 GD/CHN_2021 98.65 PP078948.1 P2 A10 GD/CHN_2021 98.96 PP078948.1 P3 A16 C138/CHW/AUS/2016 91.39 MH111071.1 2.2 系统进化分析
参考GenBank数据库中CVA10原型株Kowalik的分段方式，获得分离株155/YN/CHN/2022的VP1序列。CVA10的VP1序列的核苷酸长度为902 nt，从GenBank上选取43个CVA10的VP1序列，通过MEGA7.0软件进行进化分析得到系统进化树（图1）。根据VP1序列系统进化分析，CVA10分为7个基因型，其中原型株Kowalik属于A基因型，本研究分离株155/YN/CHN/2022属于C基因型，与近年来中国大陆流行株为同一基因型。
图 1 CVA10 VP1基因序列的系统进化树注：● 为本研究中CVA10分离株；▲为CVA10原型株。Figure 1. Neighbor-joining phylogenetic trees for CVA10 based on complete VP1 sequences将本研究中的云南省CVA10分离株与EVA各血清型原型株进行分段比对，分别构建基于P1、P2、P3基因区段的neighbor-joining系统进化树（图2）。结果显示，155/YN/CHN/2022在P1进化树中与CVA10原型株Kowalik以及国内外其他CVA10分离株聚类在同一分支，在P2进化树中与大多数CVA10分离株位于同一分支，但没有与CVA10原型株Kowalik以及CVA10分离株13-2357-1、SJ20-1、NSW-V23-2007-CVA10聚类，在P3区，155/YN/CHN/2022与U22521.1/EV71、AY421761.1/CVA3/Olson、AY421768.1/CVA12/Texas-12遗传距离较近，而非与CVA10原型株遗传距离最近。
图 2 CVA10毒株与 EVA不同血清型毒株的 P1、P2 和 P3 区系统进化树 （从左到右分别为P1、P2和P3区系统进化树）注：P1、P2 和 P3 区系统进化树图中的“●”为本研究中的CVA10毒株；“▲”为CVA10原型株；“■”为其他CVA10分离株。Figure 2. Phylogenetic trees of P1，P2 and P3 regions of CVA10 strain and EVA serotype strains in this study （P1，P2 and P3 region phylogenetic trees from left to right，respectively）2.3 重组分析
为了进一步验证CVA10云南分离株155/YN/CHN/2022可能出现的重组事件，利用Simplot3.5.1软件进行BootScan和SimPlot分析（图3）。以155/YN/CHN/2022为质询序列，结果表明，CVA10云南分离株155/YN/CHN/2022在P1区与CVA10原型株Kowalik相似度最高，在2C区段与CVA2原型株Fleetwood相似度最高，在3D区段与EV71、CVA5/Swartz相似性最高。
图 3 155/YN/CHN/2022分离株与EVA各血清型全基因组序列 Simplot和 Bootscan分析A：Simplot分析；B：Bootscan分析。Figure 3. BootScan and SimPlot analysis of whole genome sequences of 155/YN/CHN/2022 strain and EVA prototypes2.4 氨基酸突变分析
与CVA10原型株Kowalik相比，155/YN/CHN/2022分离株的VP1区共有21个氨基酸位点突变，分别为第 13、16、21、23、24、25、27、28、31、33、70、78、81、107、142、148、223、240、261、285、291位（图4）。
图 4 155/YN/CHN/2022分离株与CVA10原型株Kowalik的VP1氨基酸序列比较Figure 4. Comparison of VP1 amino acid sequence of isolate 155/YN/CHN/2022 with CVA10 prototype strain Kowalik3. 讨 论
3.1 进化分析
手足口病病原谱复杂，不同血清型肠道病毒感染引起的手足口病临床表现略有差异。感染CVA10通常会导致轻微且具有自我限制性的疾病症状，如发热、口腔内溃疡、手足部位出现皮疹或水疱疹等，但其高传染性和易感人群的广泛性，使其在儿童中传播迅速，造成一定的社会和经济负担。此外，CVA10感染者中也会出现少数严重病例，如无菌性脑膜炎、脑炎和心肌炎等，甚至可能导致患者死亡[10]。因此，加强对CVA10的病原学监测及分子流行病学研究，对手足口病的防范和控制具有重要意义。
通过对核苷酸和氨基酸一致性分析显示，本研究分离株与其他CVA10流行株之间的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为91.18%～95.06%和97.63%～98.54%，核苷酸差异明显高于氨基酸差异，这提示CVA10在进化过程中发生了较多的同义突变，氨基酸较为保守，有利于疫苗的研发。目前，关于CVA10病毒的基因分型尚未形成公认的标准。参考前人文献中基于VP1区序列的分型方法[11]，将CVA10分为7个基因型（Ａ、B、C、D、E、F、G基因型）。2009年以后，我国大陆的主要流行株为C基因型[12−13]，本研究中的CVA10云南分离株155/YN/CHN/2022也属于C基因型，与近几年国内流行株位于同一进化分支。VP1进化分析图显示，在我国大陆的CVA10流行株中， C基因型远多于其他基因型，且在2009年后，除少数几株分离株为其他基因型外，其余分离株均属于C基因型，与本研究中的CVA10毒株分型结果一致，提示云南省CVA10病毒的流行趋势可能暂未发生变化[14]。
3.2 重组分析
肠道病毒进化和基因结构塑造的主要驱动力是RNA重组[15]。在人类肠道病毒A组的进化过程中，自然重组是常见事件之一。P1、P2、P3系统进化分析发现，云南省分离株155/YN/CHN/2022在P3进化树中与EVA内其它血清型原型株，而非CVA10原型株，遗传距离更近；Simplot分析中，该分离株在P1区与CVA10原型株相似性最高，而在其他基因区段与各EVA血清型原型株的相似性较高，多种EVA血清型在多个区域与155/YN/CHN/2022的相似性高于CVA10原型株；BLAST比对中，155/YN/CHN/2022分离株在3D和3'UTR区均与CVA16毒株相似性最高，提示该毒株在进化过程中可能与各EVA血清型毒株发生重组。基因重组可能会导致新的病毒株的出现，增加病毒的多样性和复杂性，并影响疫苗和抗病毒药物效果[16]。因此，需密切关注CVA10病毒的演化动态，以能及时发现并应对可能出现的毒株变化情况。
3.3 氨基酸突变分析
VP1区是肠道病毒的主要抗原决定簇，相关肠道病毒的研究表明，VP1突变可能导致影响病毒组装和脱壳的结构变化。例如，在肠道病毒71（EV71）中，VP1 A107调节病毒组装过程中VP0前体的有效裂解，这对病毒粒子成熟和随后的脱壳至关重要[17]。针对CVA10氨基酸突变位点对病毒的生物学特性和疾病发生的影响的研究较少，还需进行深入研究。本研究的155/YN/CHN/2022分离株与近几年中国大陆CVA10流行株的VP1区氨基酸主要突变位点相符，未见较大变化，提示近年来CVA10的生物学特性可能变化不大[14，18]。
综上所述，本研究针对从手足口病患儿粪便标本中分离得到的CVA10云南分离株155/YN/CHN/2022，进行了全基因组测序，并对其全基因组序列进行了系统进化分析及重组分析，为深入探索CVA10病毒的病原学特性和流行变化提供了实验参考数据，有助于CVA10病毒引发的相关疾病的预防和控制。
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图 1 CVA10 VP1基因序列的系统进化树
注：● 为本研究中CVA10分离株；▲为CVA10原型株。
Figure 1. Neighbor-joining phylogenetic trees for CVA10 based on complete VP1 sequences
图 2 CVA10毒株与 EVA不同血清型毒株的 P1、P2 和 P3 区系统进化树 （从左到右分别为P1、P2和P3区系统进化树）
注：P1、P2 和 P3 区系统进化树图中的“●”为本研究中的CVA10毒株；“▲”为CVA10原型株；“■”为其他CVA10分离株。
Figure 2. Phylogenetic trees of P1，P2 and P3 regions of CVA10 strain and EVA serotype strains in this study （P1，P2 and P3 region phylogenetic trees from left to right，respectively）
图 3 155/YN/CHN/2022分离株与EVA各血清型全基因组序列 Simplot和 Bootscan分析
A：Simplot分析；B：Bootscan分析。
Figure 3. BootScan and SimPlot analysis of whole genome sequences of 155/YN/CHN/2022 strain and EVA prototypes
图 4 155/YN/CHN/2022分离株与CVA10原型株Kowalik的VP1氨基酸序列比较
Figure 4. Comparison of VP1 amino acid sequence of isolate 155/YN/CHN/2022 with CVA10 prototype strain Kowalik
表 1 全基因组序列扩增及测序引物
Table 1. Primers for whole genome sequence amplification and sequencing
引物 序列（5'→3'） 核苷酸位置 方向 A-OAS GGRTANCCRTCRTARAACCAYTG 3109 –3089 反向引物 A-OS CCNTGGATHAGYAACCANCA 2268 –2287 正向引物 E201F TTAAAACAGCCTGTGGGTTG 1–20 正向引物 A10N1r GGGTTGCCCCATAGGCAG 812–795 反向引物 A10N1f GTAGCCACTGGAGGATCT 1052 -1069 正向引物 A10N2R CACAGCTTGTTGTGTCACTT 2511 -2493 反向引物 A10N3F CATGTATGTGCCCCCTGGCG 3261 –3280 正向引物 A10N4f CTTAGGCCGCTTAGATGC 3960 –3977 正向引物 A10N5r CCAAGGACACAATATGTC 6598 –6581 反向引物 A10N6f TTGGTTCCGAGGGAGCGG 7042 –7059 正向引物 A10N7f CTTGCCAGATCACCAATT 6046 –6063 正向引物 CA168R GGTTATAACAAATTTACCCCC 7404 –7385 反向引物 
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表 2 CVA10分离株与其原型株、其他CVA10株核苷酸和氨基酸一致性比对
Table 2. Nucleotide and amino acid sequence identity comparison of CVA10 isolate with prototype and other CVA10 strains in all sequenced genomic regions
基因组
区域原型株 其他A10分离株 核苷酸
一致性（%）氨基酸
一致性（%）核苷酸
一致性（%）氨基酸
一致性（%）5'UTR 83.9～96.2 95.98～98.39 VP4 77.78 94.20 94.69～98.55 94.20～100 VP2 77.66 96.08 93.59～98.30 96.08～100 VP3 76.69 94.3～98.3 93.65～99.15 91.2～100 VP1 76.87 92.95 95.97～100 98.66～100 2A 81.33 95.33 94.22～99.11 92.67～99.33 2B 78.84 96.97 93.94～98.99 95.96～100 2C 83.50 96.05 94.33～98.89 99.39～99.7 3A 82.95 95.35 94.57～90.61 96.51～100 3B 90.91 100.00 93.94～98.48 89.3～96.8 3C 78.08 95.08 93.98～97.87 90.71～97.27 3D 83.08 95.24 90.70～97.12 95.89～97.84 3'UTR 93.83 93.42～97.01 Genome 78.43 95.30 91.18～95.06 97.63～98.54
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表 3 155/YN/CHN/2022分离株与其他EVA病毒分离株之间的基因组不同区域的一致性比较
Table 3. Consistency comparison of different genomic regions between 155/YN/CHN/2022 isolates and other EVA virus isolates
基因区段 血清型 毒株 核苷酸同源性（%） 基因登陆号 5'UTR CVA10 PD19-80 98.39 MW929277.1 VP4 A10 144_GD/CHN_2021 98.55 PP078948.1 VP2 A10 GD/CHN_2021 98.30 PP078947.1 VP3 A10 GD/CHN_2021 99.15 PP078948.1 VP1 A10 A296-YN-CHN-2022 100.00 LC791297.1 2A A10 GD/CHN_2021 99.11 PP078948.1 2B A10 GD/CHN_2021 98.99 PP078948.1 2C A10 GD/CHN_2021 98.89 PP078948.1 3A A10 GD/CHN_2021 99.61 PP078948.1 3B A10 GD/CHN_2021 98.48 PP078948.1 3C A10 GD/CHN_2021 97.87 PP078948.1 3D A16 CVA16/TH/MUMT-1/2016 97.12 OM417116.1 3'UTR A16 V18-026 97.01 MH780757.1 Genome A10 GD/CHN_2021 95.06 PP078948.1 P1 A10 GD/CHN_2021 98.65 PP078948.1 P2 A10 GD/CHN_2021 98.96 PP078948.1 P3 A16 C138/CHW/AUS/2016 91.39 MH111071.1
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