Genomic Analysis of Cellular Senescence and Osteoporosis Target Genes and Small Molecule Screening
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摘要:
目的 利用公共数据库中的数据探索衰老与骨质疏松的共同靶基因，筛选有潜在治疗作用的小分子化合物。 方法 从公共基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）中下载骨质疏松数据集GSE56814和GSE56815并合并，从Genecard数据库和Cell age数据库中选取衰老基因并合并，使用R软件对数据进行清洗，筛选出差异基因，制作火山图，进行加权基因共表达筛选出关键模块和基因以及使用机器学习方法筛选靶基因，利用微生信平台绘制韦恩图，Cytoscape软件进行蛋白互作结果可视化，使用STRING 数据库进行差异编码蛋白的相互作用分析，利用Cmap数据库进行小分子化合物的预测。绘制受试者工作特征曲线，找出最有意义的靶基因，在此基础上建立逻辑回归模型并绘制列线图。 结果 使用limma包共筛选出127个差异基因。对差异基因进行加权基因共表达网络分析，筛选出103个高表达基因。采用拉索回归、支持向量机和随机森林模型3种机器学习方法，最终获得4个靶基因：FOXO3、HIRA、CBX5、RAD1。列线图和校准曲线显示出良好的预测效果。使用Cmap数据库筛选出有潜在治疗作用的5种小分子化合物：樱黄素（O-甲基化异黄酮）、XMD-885、杠柳次苷、依维莫司和XMD- 1150 。结论 FOXO3、HIRA基因目前已证实是衰老和骨质疏松共同的靶基因，樱黄素对衰老和骨质疏松有潜在治疗作用。 Abstract:Objective To explore common target genes related to aging and osteoporosis using data from public databases and to screen for small molecule compounds with potential therapeutic effects. Methods Osteoporosis datasets GSE56814 and GSE56815 were downloaded and merged from the public gene expression database （Gene Expression Omnibus （GEO）） . Senescent genes were selected and merged from the genecard database and the cell age database. Data cleaning and differential gene selection were performed using R software, and a volcano plot was created. Weighted gene co-expression network analysis was performed to screen out key modules and genes, and the machine learning methods were employed to screen target genes. A Venn diagram was drawn using the the Microbioinformatics platform, and cytoscape software was used to visualise protein interactions results. Interaction analysis of differentially encoded proteins was carried out using the STRING database, and prediction of small molecule compounds was carried out using Cmap database. Finally, Receiver operating characteristic （ROC） curves were plotted to find out the most meaningful target genes, followed by the establishment of a logistic regression model and the creation of a nomogram. Results A total of 127 differential genes were screened using the limma package. Weighted gene co-expression network analysis was performed on the differential genes and 103 highly expressed genes were screened. Three machine learning methods, lasso regression, support vector machine and random forest model, were used to finally obtain four target genes: FOXO3, HIRA, CBX5 and RAD1. The nomogram and calibration curves showed good predictive results. Five small molecule compounds with potential therapeutic effects were identified using the Cmap database: sakuraflavin （O-methylated isoflavone）, XMD-885, kangaroo hyoscyamine, everolimus and XMD-1150. Conclusion FOXO3 and HIRA genes have now been confirmed to be the common target genes for aging and osteoporosis, and sakuraflavin has potential therapeutic effects on both conditions. -
Key words:
- Cellular senescence /
- Osteoporosis /
- Target genes /
- Small molecule compounds /
- Genomic analysis
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衰老（Cellular senescence）是一个普遍且不可避免的生理衰退过程，随着人口老龄化程度加剧，衰老及相关疾病成为全球亟待解决的重大难题[1]。中国在20世纪也进入老龄化社会，根据2020年全国第七次人口普查和2022年国家统计局公布的数据，我国60 岁及以上人口占比分别为18.70%、19.8%，人口老龄化的后果是衰老相关疾病骤增 [2−3]。研究[4−5]表明，衰老与多种疾病的发生密切相关，包括心血管疾病、神经退行性疾病、癌症、糖尿病和骨质疏松症等。这些疾病被称为年龄相关疾病，其共同特点是随年龄增长发病率显著增加。在衰老过程中，基因组稳定性、端粒长度、表观遗传状态和蛋白质稳态都会发生显著变化，这些变化不仅影响细胞的正常功能，还促进了多种疾病的发生和发展[6]。慢性低度的系统性炎症（即炎症性衰老）与多种年龄相关疾病密切相关，包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默病和骨质疏松症等[7]。此外，细胞衰老、线粒体功能障碍和氧化应激等过程也在衰老中发挥关键作用[8]。深入研究衰老的分子机制有助于开发新的治疗策略，从而延缓衰老过程，预防和治疗年龄相关疾病，提高老年人的生活质量和寿命。
骨质疏松症是一种常见的代谢性骨病且与年龄相关，其特征是骨量减少和骨微结构退化，导致骨脆性增加和骨折风险升高[9−10]。骨质疏松症的分子机制主要包括骨吸收与骨形成的不平衡，即破骨细胞介导的骨吸收超过成骨细胞介导的骨形成。这种不平衡的主要原因包括雌激素缺乏、炎症、氧化应激、细胞衰老和表观遗传因素[11]。这些因素共同促进了骨质疏松症的发生发展，导致骨密度和骨质量的下降[12]。研究表明，微小RNA（miRNA）、氧化应激和炎症在骨质疏松症的发展中发挥了关键作用，通过调控基因表达和细胞信号传导途径影响骨代谢[13]。此外，肠道微生物群和免疫系统的相互作用也被认为在骨质疏松症中具有重要作用，通过调节骨代谢和免疫反应影响疾病进程[14]。当前的治疗方法包括抗吸收药物和促成骨药物，但这些药物的长期使用可能会导致严重的副作用，因此需要新的治疗策略来更有效地管理这种疾病[15]。深入研究骨质疏松症的分子机制有助于开发新的治疗策略，提高患者的生活质量[16]。
衰老与骨质疏松症密切相关，二者共享许多分子机制，包括炎症、氧化应激和细胞衰老。随着年龄的增长，这些机制导致骨量减少和骨强度降低，从而增加骨折风险。研究表明，随着年龄增加，衰老细胞会在骨组织中积累并表现出衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP），导致骨稳态失衡、骨质减少、骨小梁结构改变、骨脆性增加，从而引发骨质疏松症[17]。其次，随着年龄增长，骨髓基质细胞（ bone marrow stromal cells，BMSCs）大部分分化为脂肪细胞而不是成骨细胞，并发生衰老，从而导致骨形成减少，导致老年性骨质疏松[18]。此外，衰老也能通过影响腔隙-骨管系统，影响细胞间通讯以及对骨骼负荷和运动对骨形成的反应，从而引起骨质退化[19−20]；衰老可直接影响成骨细胞的分化和功能[21]等多种途径，引发骨质疏松。本研究拟从分子角度出发，寻找衰老和骨质疏松症的共同候选基因，揭示衰老致骨质疏松的潜在生物学过程，为骨质疏松诊疗提供新理论及新靶点。
1. 材料与方法
1.1 数据来源
以“Osteoporosi”为关键词在GEO数据库（gene expression omnibus; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中找到了GSE56814和GSE56815两个数据集，并将两个数据集进行合并。数据集GSE56814包括高BMD（对照组）42个和低BMD（病例组）31个，数据集GSE56815包括高BMD（对照组）40个和低BMD（病例组）40个。笔者使用“cellular senescence”为关键词在Genecard数据库（GeneCards-HumanGenes|Gene Database|Gene Search；https://www.genecards.org/）中找到了衰老相关数据集，选取“Relevance score”大于7分的基因，共537个，在Cell age数据库（CellAge: The cell senescence gene database；https://genomics.senescence.info/cells/）中获得了另一个衰老基因的数据集，共605个，对两个数据集进行合并，共收集到952个基因。
1.2 数据分析
1.2.1 差异基因分析
使用R4.3.3软件对骨质疏松症（OP）两个数据库的数据进行合并，合并后的数据进行简单清洗和去重，使用“limma”包进行批次矫正，以P < 0.05筛选出差异基因（differentially expressed genes，DEGs），并设置logFC>0为上调基因，logFC<0为下调基因。使用R软件中的“ggplot”包绘制火山图，使用微生信平台（bioinformatics.com.cn）绘制韦恩图。
1.2.2 加权基因共表达网络
将得到的DEGs，进一步进行加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA），使用R软件中的WGCNA包，设置软阈值为6，得到高表达的基因模块。
1.2.3 蛋白互作
再将WGCNA中得到的高表达基因放入STRING 数据库（https://string db.org/），分析这些高表达基因编码蛋白的相互作用 （protein-protein interaction，PPI）。再使用Cytoscape软件进行PPI结果的可视化分析，选取关键基因。
1.2.4 GO-KEGG富集分析
将OP的DEGs与衰老基因取交集，得到在两个疾病中都表达的基因，将这些基因上传至微生信平台进行GO和KEGG富集分析，识别这些基因的通路和生物学过程。
1.2.5 机器学习方法
将上述交集基因采用机器学习方法进行降维，筛选靶基因。分别采用拉索回归（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）、支持向量机（support vector machines，SVM）以及随机森林（random forest）进行筛选，对3种机器学习方法的筛选结果取交集，以选出靶基因。
1.2.6 ROC曲线
使用R软件中的“pROC”包对筛选出的靶基因绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）曲线，以曲线下面积（area under curve，AUC）值来判断靶基因的诊断能力，设置AUC>0.7为有效。在此基础上构建逻辑回归模型并绘制列线图，用ROC曲线来评价该模型的预测效果。
1.2.7 Cmap小分子化合物预测
从wgcna的上调基因里挑出前5个基因，与17个DEGs取交集，共21个，使用Cmap数据库（ConnectivityMap；https://clue.io/）预测有潜在治疗作用的小分子化合物，鉴定标准为：连通性评分为负。
2. 结果
本研究从多个数据库获取骨质疏松和衰老数据集，清洗后分析得127个差异表达基因，与942个衰老相关基因取交集得17个共同基因。经GO、KEGG分析明确其生物通路，再用LASSO、SVM和随机森林算法确定4个关键靶基因。通过WGCNA识别高表达模块并进行了PPI蛋白互作分析，结合Cmap数据库预测出5种潜在治疗药物，见图1。
2.1 差异基因分析
GEO数据集的OP基因共包含73个样本的
11121 个基因，有127个差异基因被鉴定为OP的DEGs，其中上调基因44个，下调基因83个，见图2A。韦恩图显示了OP的DEGs与Cellular senescence共同的17个基因，见图2B。
图 2 差异基因结果及交集A：差异基因火山图结果；B：骨质疏松与衰老基因交集。Figure 2. Differential gene results and intersections2.2 加权基因共表达网络分析
使用R软件中的WGCNA包来识别DEGs中的高表达基因，首先基于加权相关性，进行层次聚类分析，同一枝上的基因具有跟高的相似性，见图3A。其次，选取最优软阈值为6，使构建的网络更符合无标度拓扑结构，见图3B。基于最优软阈值构建共表达网络，将基因划分到不同模块后，绘制基因聚类树，见图3C。通过基因树图的层次聚类分析和动态分支切割方法，OP数据集中的DEGs被聚类为两个模块，其中高表达模块为MEturquoise，103个DEGs包含在其中，见图3D。
图 3 加权基因共表达分析结果A：样本聚类图；B:软阈值；C：基因聚类树；D：模块与临床相关性。Figure 3. Weighted gene co-expression analysis results2.3 蛋白互作网络分析
将WGCNA中得到的103个高表达基因放入STRING 数据库，分析这些高表达基因编码蛋白的相互作用，获得这些基因的相互作用数据，将其导入Cytoscape进行PPI结果的可视化，采用Degree无权重法，计算结果取前15个基因作为重要节点，见图4。
2.4 GO和KEGG富集分析
将OP的DEGs与Cellular senescence共同的17个基因上传至微生信平台进行GO和KEGG生物富集。共获得57个GO条目，其中BP（生物过程）30个，CC（细胞成分）12个，MF（分子功能）15个。BP方面，核心基因主要富集在转录的负调控（GO:0045892）、对细胞凋亡过程的调控（GO:0042981）、细胞对 DNA 损伤刺激的反应（GO:0006974）和对 RNA 聚合酶 II 启动子的转录进行正向调节（GO:0045944）上；CC方面，核心基因主要富集于细胞核（GO:0005654）；对于MF，核心基因主要富集于转录核心抑制因子活性（GO:0003714）和蛋白质结合（GO:0005515）；KEGG主要富集在五条通路上，分别是细胞衰老（hsa04218）、细胞周期（hsa04110）、帕金森病（hsa05012）、铁中毒（hsa04216）和长寿调节途径 - 多物种（hsa04213），见图5。
图 5 17个交集基因的GO-KEGG富集分析A：BP；B：CC；C：MF；D：KEGG。Figure 5. GO-KEGG enrichment analysis of 17 intersecting genes2.5 机器学习方法
基于上述17个基因，采用LASSO回归、SVM以及Random Forest进行靶基因的筛选。LASSO回归采用十折交叉验证，确定了7个靶基因，见图6A、6B；SVM采用五折交叉验证，确定了15个靶基因，见图6C；Random Forest选取了MeanDecreaseGini值>5的基因，共5个，见图6D。上述三种机器学习方法取交集，最终得出4个靶基因：FOXO3、HIRA、CBX5、RAD1，见图6E。
图 6 机器学习筛选靶基因A：17个基因的LASSO系数路径图；B：交叉验证曲线；C：SVM-RFE；D：随机森林15个基因重要性；E：三种机器学习方法筛选基因的交集。Figure 6. Machine learning screening of target genes2.6 ROC曲线分析
笔者在R软件中绘制了上述4个靶基因的ROC曲线，根据AUC值以确定其诊断价值。其中CBX5基因的ROC曲线最佳截断值为7.961，灵敏度为91.5%，特异度为90.1%；FOXO3基因的ROC曲线最佳截断值为8.598，灵敏度为79.3%，特异度为100%；HIRA基因的ROC曲线最佳截断值为7.801，灵敏度为89%，特异度为100%；RAD1基因的ROC曲线最佳截断值为7.6，灵敏度为86.6%，特异度为100%。结果显示，4个靶基因的AUC值均大于0.7，对疾病的诊断有明显价值，见图7。
图 7 4个靶基因的受试者工作曲线A：CBX5基因的ROC；B：FOXO3基因的ROC；C：HIRA基因的ROC；D：RAD1基因的ROC。Figure 7. ROC curves for the four target genes2.7 逻辑回归模型建立与列线图可视化
为了更直观地了解4个靶基因与衰老和骨质疏松发病的关系，笔者基于逻辑回归模型绘制了列线图，构建的逻辑回归方程式为：log（$ \frac{p}{1-p} $）=-12.18-4.34x1-1.31x2+2.80x3+3.89x4。其中P值代表发生骨质疏松症的概率，x1代表CBX5的基因表达水平，x2代表HIRA的基因表达水平，x3代表RAD1的基因表达水平，x4代表FOXO3的基因表达水平。绘制了ROC曲线评价该模型的预测效果。结果显示，ROC曲线下面积为0.984，证明了该模型在疾病诊断方面有良好的诊断效果，从而验证了4个靶基因的诊断作用，见图8。
图 8 4个靶基因的列线图与ROC曲线A：4个靶基因列线图；B：逻辑回归模型的预测效果ROC曲线。Figure 8. Nomogram and ROC curves for the four target genes2.8 Cmap筛选小分子化合物
将蛋白互作得到的103个高表达基因取前5个，与17个基因取并集，共21个基因，将这些基因放入Cmap网站，通过Cmap数据库分析可能缓解衰老和骨质疏松的小分子药物，连通性评分为负表明该化合物对所研究疾病为保护因素，反之则为危险因素，且评分越高作用效果可能越大。结果表明，最有希望对衰老和骨质疏松起作用的药物是樱黄素（O-甲基化异黄酮）、XMD-885、杠柳次苷、依维莫司和XMD-
1150 ，见表1。表 1 CMap分析发现的潜在衰老和骨质疏松症药物小分子化合物Table 1. Potential small molecular compounds for aging and osteoporosis found in CMap analysis连通性评分 药物名称 说明 −98.39 prunetin Breast cancer resistance protein inhibitor −97.82 XMD-885 Leucine rich repeat kinase inhibitor −97.64 periplocymarin Apoptosis stimulant −96.95 everolimus MTOR inhibitor −96.37 XMD- 1150 Leucine rich repeat kinase inhibitor 3. 讨论
3.1 骨质疏松症的衰老机制和干预措施
随着全球人口老龄化，骨质疏松症的发病率呈现上升趋势，对公共卫生和医疗资源构成了巨大挑战。首先，衰老是导致骨质疏松的重要因素之一。随着年龄的增长，骨骼的形成与吸收之间的平衡逐渐失调，骨形成的速度无法跟上骨吸收的速度，导致骨量减少和骨强度下降。这种现象在绝经后的女性和老年男性中尤为明显[22]。研究表明，细胞衰老是影响骨质疏松的重要机制之一。衰老细胞的积累会释放出多种促炎性细胞因子，加速骨吸收和骨质流失[23]。激素变化在骨质疏松的发展中起到了关键作用。已有研究表明[24]，老年人中甲状腺刺激素（TSH）水平的上升对骨质有保护作用，而雌激素、睾酮、胰岛素样生长因子1（IGF1）和维生素D的下降则有助于骨质的流失。此外，皮质醇和促卵泡激素（FSH）的上升也会促进骨吸收，增加骨质疏松的风险[25]。骨髓脂肪组织（BMAT）的增加也是导致骨质疏松的一个重要机制。研究发现，在肥胖和2型糖尿病患者中，骨髓脂肪的增加会抑制骨形成，增加骨折风险[26]。这些代谢紊乱与老年人骨质疏松密切相关。营养和生活方式的干预在骨质疏松的预防和治疗中也显得尤为重要。足够的钙和维生素D摄入，以及规律的体育锻炼，有助于增加骨密度，减少骨质疏松性骨折的风险[27]。相反，吸烟、酗酒和久坐生活方式则会加速骨质流失[28]。衰老对骨骼的机械适应性响应也有显著影响。研究表明，老年人的骨骼对机械负荷的响应能力下降，导致骨质流失增加。然而，创新性的高冲击负荷训练可以增强老年人骨骼的机械适应性，有助于维持骨健康[29]。衰老是骨质疏松的主要诱因之一，其机制包括细胞衰老、激素变化、骨髓脂肪增加以及机械适应性响应能力的下降。通过综合营养、生活方式干预和创新的运动疗法，可以有效预防和治疗骨质疏松。
3.2 骨质疏松与衰老相关的基因研究
本研究中，笔者使用三种机器学习方法确定了17个DEGs中的4个靶基因，其中FOXO3、HIRA2个基因在鉴定骨质疏松和衰老方面的作用已经在其他文献中有报道：FOXO3基因可以通过转录调控参与 DNA 损伤反应和氧化应激抵抗的基因来调节细胞衰老、凋亡和自噬，从而决定细胞命运[30]，HIRA基因对骨质疏松症的潜在诊断作用则在2017年一项对GEO数据库中67个骨质疏松症血样和62个对照血样的系列研究中得以验证[31]。在本研究中笔者发现CBX5、RAD1两个基因在衰老和骨质疏松方面有相互作用且目前暂未发现研究报道。
3.3 小分子化合物樱黄素对骨质疏松的治疗作用
相关小分子化合物研究结果揭示，樱黄素（Prunetin）是一种 O-甲基化异黄酮，具有抗炎活性，已经有大量研究显示樱黄素对各种疾病存在治疗功能，如樱黄素可以通过CASP3和TNF-α基因抑制一氧化氮活性并诱导膀胱癌细胞凋亡[32]、通过阻断钙通道降低大鼠血压[33]、通过 G 蛋白偶联受体 GPR30 （GPER1）诱导成骨细胞中的 Runx2 表达以促进骨再生[34]。 同时，它也是本研究预测出最有可能对衰老和骨质疏松有治疗效果的小分子化合物，其对骨质疏松的治疗作用表现出多靶点，多途径相互作用的特点：樱黄素可能通过与ESR1、PTGS2、FGFR1和ALB蛋白相互作用，抑制破骨细胞的分化潜力，从而治疗骨质疏松症；樱黄素可以有效减轻地塞米松对ALP（成骨分化的早期指标）活性的抑制作用，从而治疗骨质疏松症[35]。而其他几种小分子化合物对合并衰老和骨质疏松的治疗作用有待进一步研究。
3.4 衰老与骨质疏松未来研究展望
骨质疏松症已成为一个日益严重的公共健康问题。未来的研究应继续深入探讨衰老与骨质疏松症之间的复杂关系，特别是细胞衰老在骨质疏松症中的作用机制。现有研究表明，细胞衰老及其相关的分泌表型在骨质疏松症的发生和发展中起着关键作用，针对细胞衰老的治疗策略，如清除衰老细胞或抑制SASP，可能成为未来治疗骨质疏松症的新方向[36−37]。此外，氧化应激和炎症在骨质疏松症中的作用也值得进一步研究。氧化应激不仅影响骨细胞的生成和存活，还通过多种机制加速骨质流失[38]。炎症与免疫系统的重塑同样在骨质疏松症中扮演重要角色，特别是在老年人群中[39]。未来的研究应关注如何通过调节氧化应激和炎症反应来减缓骨质疏松症的进程。
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图 2 差异基因结果及交集
A：差异基因火山图结果；B：骨质疏松与衰老基因交集。
Figure 2. Differential gene results and intersections
图 3 加权基因共表达分析结果
A：样本聚类图；B:软阈值；C：基因聚类树；D：模块与临床相关性。
Figure 3. Weighted gene co-expression analysis results
图 5 17个交集基因的GO-KEGG富集分析
A：BP；B：CC；C：MF；D：KEGG。
Figure 5. GO-KEGG enrichment analysis of 17 intersecting genes
图 6 机器学习筛选靶基因
A：17个基因的LASSO系数路径图；B：交叉验证曲线；C：SVM-RFE；D：随机森林15个基因重要性；E：三种机器学习方法筛选基因的交集。
Figure 6. Machine learning screening of target genes
图 7 4个靶基因的受试者工作曲线
A：CBX5基因的ROC；B：FOXO3基因的ROC；C：HIRA基因的ROC；D：RAD1基因的ROC。
Figure 7. ROC curves for the four target genes
图 8 4个靶基因的列线图与ROC曲线
A：4个靶基因列线图；B：逻辑回归模型的预测效果ROC曲线。
Figure 8. Nomogram and ROC curves for the four target genes
表 1 CMap分析发现的潜在衰老和骨质疏松症药物小分子化合物
Table 1. Potential small molecular compounds for aging and osteoporosis found in CMap analysis
连通性评分 药物名称 说明 −98.39 prunetin Breast cancer resistance protein inhibitor −97.82 XMD-885 Leucine rich repeat kinase inhibitor −97.64 periplocymarin Apoptosis stimulant −96.95 everolimus MTOR inhibitor −96.37 XMD- 1150 Leucine rich repeat kinase inhibitor 
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