卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是引起女性生殖障碍的常见内分泌疾病，主要临床表现为闭经，伴有雌激素（Estrogen，E₂）降低和促性腺激素升高（follicle-stimulating hormone）^[1]。近年来，其发生率逐年上升，且不断向低龄化趋势发展^[2]。POF不仅会降低女性的生育能力，还会带来诸多危害^[5]。现有的治疗方法中，常用的激素替代方案不能有效地恢复卵巢功能，干细胞治疗的有效性和安全性存疑，仅少数患者可以通过供卵获得妊娠的机会，但是目前临床上捐赠的卵子稀缺，且存在伦理问题，使得大部分POF患者的生育问题难以得到解决^[3]。因此，深入探讨POF的发病机制，为找到POF的临床治疗提供新的理论依据或干预靶点成为临床工作亟待解决的问题。

通过建立与POF患者临床症状、病理改变相似的动物模型，是研究POF的发病机制的重要方法^[4]。虽然目前没有针对动物POF的定义，但是POF动物模型应该表现出与临床上POF患者诊断相似的特征^[5]。根据POF发病机制的不同，已成功构建的模型有：D-半乳糖模型、自身免疫模型、放化疗模型、卵巢切除模型和基因敲除模型等^[6]。其中D-半乳糖诱导高半乳糖血症构建POF模型方法简便易行，造模成功率高，其内分泌改变和病理特征与POF患者临床特征相似，是较为理想的POF模型构建方法^[7]。因此，本研究拟采用D-半乳糖构建POF小鼠模型，通过采集小鼠阴道分泌物涂片观察动情周期发生紊乱，HE染色观察小鼠卵巢组织病理情况及ELISA检测性激素水平来判断造模成功，该模型符合本研究的目的，并为后续实验奠定基础。

卵巢行使其功能的基本单位是卵泡，卵巢颗粒细胞作为包绕在卵母细胞周围的重要支持细胞，通过与卵母细胞之间的广泛交流，决定了卵巢发育、闭锁、凋亡^[8]。任何导致原始卵泡减少、闭锁卵泡增加以及卵子功能异常的因素都可能会导致POF^[4]。目前普遍认为女性出现POF主要是是由于卵巢出现卵泡大量闭锁，代表卵巢储备功能的“卵泡池”中原始卵泡不足，进而导致POF，而颗粒细胞凋亡已经被公认是卵泡闭锁的主要原因^[9]。已知发病因素有遗传因素、内分泌因素及医源性因素等。其中遗传因素包含DNA损伤、染色体异常、表观遗传调控异常等^[10]。为进一步探索发病因素对于疾病机制的研究，现发现表观遗传调控在女性生殖内分泌疾病中发挥着重要作用。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenine，m6A）作为真核生物中最普遍存在的转录后RNA水平的表观遗传修饰，对调控基因表达至关重要^[11]。目前发现有甲基转移酶、去甲基化酶和阅读蛋白共同参与m6A功能的实现^[12]。其中，甲基化转移酶中甲基转移酶3（Methyltransferase-like protein 3，METTL3）作为m6A修饰甲基转移酶复合物的核心催化酶，广泛参与配子形成、胚胎发育和器官衰老等过程^[13]。已有研究表明m6A修饰与POF密切相关。但METTL3对POF的影响目前尚未见有关报道。本研究将深入探讨METTL3在POF中的作用。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   实验动物

以6～8周SPF级C57BL/6雌性小鼠为研究对象。所有小鼠均从斯贝福（北京）生物技术有限公司购买获得。动物饲养于昆明理工大学实验动物中心。饲养条件为：温度23 ℃，湿度40%～70%，每12 h交替照明，自由饮食饮水。本实验通过昆明医科大学动物伦理委员会批准（kmmu20230997）。

1.1.2   实验材料

D-（+）半乳糖，Solarbio，D8310；孕马血清促性腺激素（PMSG），Solarbio，P9970；促卵泡素（FSH）测试盒，南京建成，H101；雌二醇（E2）测试盒，南京建成，H102；BCA蛋白浓度测定试剂盒，beyotime，P0009-1；FSHR抗体，Affinity，AF5242；Anti-METTL3抗体，abcam，ab195352；Beta Actin Antibody，Affinity，AF7018； Goatanti-rabbit488，abcam，ab150081；Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP，Affinity，S0001。

1.2   方法

1.2.1   半乳糖代谢法构建POF小鼠模型

以6～8周雌性C57BL/6小鼠为研究对象。实验组小鼠（n = 15只）每天皮下注射D-半乳糖（200 mg/kg）以构建POF小鼠模型。对照组小鼠（n = 15只）皮下注射等量生理盐水作为空白对照。通过检测阴道脱落细胞观察小鼠动情周期，反应小鼠卵巢的功能变化，协助判断是否造模成功。连续处理42 d后，在动情后期予小鼠注射戊巴比妥钠全身麻醉后，摘取小鼠眼眶快速采血，离心收集上清于−20 ℃保存。颈椎脱臼法处死小鼠后，采集小鼠卵巢组织，右侧卵巢采用4%多聚甲醛固定，左侧卵巢迅速放入液氮保存。以便进行后续指标检测。

1.2.2   ELISA检测小鼠外周血、卵巢组织性激素的水平

取出冻存的两组小鼠血清和卵巢组织样本，冰上融解。卵巢组织充分匀浆，PBS清洗3遍，离心收集上清。按照ELISA试剂盒说明书检测小鼠外周血及卵巢组织性激素水平。

1.2.3   HE染色检测小鼠卵巢组织病理情况

将4%多聚甲醛室温固定过夜的小鼠右侧卵巢组织经过脱水、透明、仅蜡后石蜡包埋进行切片，按照HE染色试剂盒进行染色，中性树胶封片，倒置显微镜多视野、多角度拍片并分析结果。

1.2.4   TUNEL染色检测组织内细胞凋亡的情况

石蜡切片脱蜡处理，滴加50 μL TUNEL反应混合液37 ℃反应 1 h。将切片浸入37 ℃的洗涤液与终止反应缓冲液，PBS清洗后滴加氧化物酶标记的抗地高辛抗体于湿盒中室温反应30 min。PBS清洗后在组织切片上加0.05% DAB溶液，室温避光3 min显色。PBS清洗后室温用苏木素染液复染10 min。用PBS清洗后用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，干燥后在显微镜下观察并记录。

1.2.5   qRT-PCR检测卵巢组织中METTL3的mRNA水平

提取卵巢组织总RNA，去除基因组DNA后逆转录cDNA，采用实时荧光定量PCR检测卵巢组织METTL3的表达水平。qRT-PCR引物购买至擎科生物公司，序列如下：mMETTL3-F：5'-ACAGTCAACGAAAGAACAGCAG-3'；mMETTL3-R：5'-CTCAGAATC-AACACAAGCATCA-3'；mGAPDH-F：5'-ACCC-TTAAGAGGGATGCTGC-3'；mGAPDH-F：5'-CCCAATACGGCCAAATCCGT-3'。

1.2.6   Western blots检测METTL3的蛋白水平

提取卵巢组织总蛋白，采用BCA检测蛋白浓度，将蛋白进行制样，经过电泳、转膜，5% 脱脂奶粉封闭液室温封闭2 h，Anti-METTL3抗体和Beta Actin Antibody以1∶1000稀释后4 ℃孵育过夜。二抗采用Goat Anti-Rabbit IgG（H + L）HRP以1∶2000稀释室温孵育2 h，滴加化学发光液后将PVDF放入凝胶成像系统曝光，拍照保存。

1.2.7   小鼠原代颗粒细胞提取及鉴定

选择10只6～8周龄C57BL/6雌小鼠，腹腔注射PPMSG 20 IU促排，48 h后颈椎脱臼法处死小鼠，暴露腹腔，采集小鼠的卵巢组织，并剔除周围的脂肪、输卵管与结缔组织，PBS清洗后用1 mL注射器在立式显微镜下穿刺卵泡，释放出颗粒细胞，70 μm过滤后离心重悬，将细胞培养过夜。24 h后吸去上清，去除悬浮的卵母细胞，更换新培养基，贴壁的细胞则为卵巢颗粒细胞。消化选择部分贴壁颗粒细胞进行免疫荧光染色，固定、透膜、3% BSA封闭后，以 1∶600稀释FSHR抗体4 ℃孵育过夜，PBS清洗后加入以1∶600稀释的二抗Goatanti-rabbit488和DAPI，室温孵育2 h后PBS清洗，在荧光显微镜下观察并记录实验结果。

1.2.8   慢病毒转染

慢病毒质粒购买自复能生物科技有限公司，将质粒包装成慢病毒液−80 ℃保存。取出待转染的颗粒细胞，去除培养基，用PBS清洗，将慢病毒与完全培养基按一定的体积混匀，并加入转染增强剂polybrene混匀。将混合好的慢病毒液加到培养皿中感染。培养24 h后取出细胞，使用PBS清洗3次，更换为完全培养基继续培养。感染72 h后，用Western blots和qRT-PCR检测病毒的转染效率。

1.2.9   CCK-8法检测细胞增殖

根据CCK-8试剂盒说明书制作标准曲线。将各组完成病毒转染的颗粒细胞消化后接种于96孔板中，每组在24 h、48 h、72 h和96 h分别加入10 μL CCK-8溶液，空白对照加入等量的培养基和CCK-8溶液但不加细胞，培养2 h后用酶标仪测定在450 nm处的OD值，计算细胞活性。

1.2.10   FITC/PI双染法检测细胞凋亡

将待检测的细胞使用1.25%胰酶消化，离心去除上清，4 ℃预冷PBS清洗两遍，离心去上清，加入500 μL稀释的1 × Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞，加入5 μL的FITC荧光染色液和5 μL的碘化丙啶（PI）染色液，吹打混匀，室温避光孵育20 min，上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

1.3   统计学分析

所有数据至少重复3次独立实验，根据研究数据结果，使用 GraphPad Prism 9.0 软件进行数据统计学分析。其中，计量资料取均值±标准误（$\bar x \pm s $）来表示，两组组间比较中使用独立样本 t 检验，多组组间比较中选择单因素方差分析，当P < 0.05 为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   POF小鼠模型构建

2.1.1   小鼠阴道涂片观察小鼠动情周期变化

阴道分泌物涂片观察小鼠动情周期变化可以反应小鼠卵巢功能。小鼠正常动情周期为4～5 d，动情周期紊乱和动情间期延长是卵巢早衰的重要标志。本实验中，采用t检验比较两组小鼠的动情周期并统计，结果显示，POF组小鼠处于动情间期的比例显著增加，差异具有统计学意义（P < 0.05），表明POF小鼠明显发生动情周期紊乱，见图1。

图  1  两组小鼠动情周期变化

A ：两组小鼠阴道分泌物涂片周期变化； B ：两组小鼠动情周期情况。^*P < 0.05；^****P < 0.0001。

Figure  1.  Changes in the estrous cycle of mice in the two groups

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2.1.2   HE染色检测小鼠卵巢组织病理改变

通过采用HE染色检测两组小鼠卵巢组织的病理情况，结果显示，对照组小鼠的卵泡与POF组比较圆润，周围颗粒细排列整齐，间质正常。而POF组的闭锁卵泡明显增加，总卵泡数减少，颗粒细胞排列稀疏，见图2。

图  2  两组小鼠卵巢组织 HE染色观察小鼠卵巢组织病理变化

A：对照组小鼠卵巢组织；B：POF组小鼠卵巢组织；C：对照组小鼠卵巢组织中卵泡；D：POF组小鼠卵巢组织中卵泡。表示黄体，表示有腔卵泡，表示闭锁卵泡。

Figure  2.  Observation on the pathological changes of mouse ovarian tissues by HE staining in the two groups of mice

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2.1.3   ELISA检测小鼠外周血的性激素水平

性激素水平是评价女性卵巢功能的重要指标。本研究采用ELISA检测两组小鼠外周血的性激素水平，t检验进行比较，POF组小鼠外周血的FSH水平（29.28 ± 2.14）IU/mL较对照组（14.25 ± 1.36） IU/mL增加，POF组E₂水平（284.44 ± 27.49 pg/mL）较对照组（1041.34 ± 78.81） pg/mL显著降低（P < 0.05），见图3。

图  3  ELISA检测小鼠外周血的性激素水平结果

A：小鼠外周血的FSH激素水平变化； B：小鼠外周血的E₂激素水平变化。^**P < 0.01；^****P < 0.0001。

Figure  3.  Results of hormone level detection in mouse peripheral blood using ELISA

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2.2   组织水平研究METTL3与POF的相关性

2.2.1   TUNEL染色检测小鼠卵巢组织内细胞凋亡水平

本研究，笔者通过对POF组和对照组小鼠的卵巢组织切片进行TUNEL染色检测细胞的凋亡水平。结果显示，DAPI染色（蓝色），TUNEL染色（红色），POF组小鼠卵巢组织石蜡切片在荧光显微镜下观察到红染的凋亡颗粒细胞较对照组明显增加，见图4。

图  4  TUNEL染色检测卵巢组织细胞凋亡

Figure  4.  Detection of apoptosis of ovarian tissue cells by TUNEL staining

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2.2.2   qRT-PCR检测小鼠卵巢组织甲基转移酶METTL3的mRNA表达水平

为了验证METTL3与POF的相关性，本研究通过qRT-PCR检测小鼠卵巢组织中METTL3的mRNA表达水平，t检验分析结果，POF组METTL3表达水平（523.11 ± 213.89）较对照组（1.23 ± 0.09）显著上调（P < 0.05），见图5。

图  5  qRT-PCR检测小鼠卵巢组织METTL3的mRNA表达水平

^**P < 0.01。

Figure  5.  Detection of the mRNA expression level of METTL3 in mouse ovarian tissues by qRT-PCR

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2.2.3   Western blots检测小鼠卵巢组织中甲基转移酶METTL3的蛋白表达水平

通过Western blots检测两组小鼠卵巢组织中甲基转移酶METTL3的蛋白表达水平，与对照组比较，POF组METTL3的表达水平显著上调（P < 0.05），见图6。

图  6  Western blots检测小鼠卵巢组织的甲基转移酶METTL3的蛋白表达水平

Figure  6.  Detection of the protein expression level of the methyltransferase METTL3 in mouse ovarian tissues by Western blots

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2.3   细胞水平研究METTL3调控颗粒细胞凋亡参与POF的机制

2.3.1   颗粒细胞免疫荧光鉴定

为进一步在细胞水平探讨METTL3调控POF的机制，在PMSG促排后颈椎脱臼法处死小鼠，采集小鼠颗粒细胞进行培养。使用卵巢颗粒细胞特异性抗体FSHR标记，进行细胞免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察结果显示，FSHR标记率可达90%以上，DAPI与FSHR可以共定位标记卵巢颗粒细胞，表明该方法分离培养的颗粒细胞纯度较好，见图7。

图  7  小鼠卵巢颗粒细胞染色鉴定

Figure  7.  Identification of granulosa cells in mouse ovaries through staining

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2.3.2   Western blots检测慢病毒的转染效率

将各组慢病毒液转染至小鼠颗粒细胞后，连续培养72 h，使用嘌呤霉素筛选稳转录细胞株。提取蛋白进行Western blots检测METTL3的表达水平，验证慢病毒的转染效率。METTL3 OE组的METTL3表达水平显著上升（P < 0.05），METTL3 sh的表达水平显著降低（P < 0.05），见图8。

图  8  Western blots检测慢病毒的转染效率

Figure  8.  Detection of the transfection efficiency of lentivirus by Western blots

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2.3.3   qRT-PCR检测颗粒细胞中METTL3的mRNA表达水平

通过RT-PCR检测小鼠卵巢颗粒细胞中METTL3的表达，METTL3OE组的METTL3表达水平（1.33 ± 0.09）较其空载对照METTL3 OENC（0.97 ± 0.03）上调（P < 0.05）。METTL3 sh组的METTL3表达水平（0.47 ± 0.01）较其空载对照METTL3 shNC（1.16 ± 0.06）降低（P < 0.05），见图9。

图  9  qRT-PCR检测卵巢颗粒细胞METTL3的mRNA表达水平

^***P < 0.0002，^****P < 0.001。

Figure  9.  Detection of the mRNA expression level of METTL3 in ovarian granulosa cells by qRT-PCR

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2.3.4   FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况

为了明确METTL3对卵巢颗粒细胞的影响，本研究通过构建METTL3过表达及敲低慢病毒质粒转染小鼠颗粒细胞后，通过FITC/PI双染法检测细胞凋亡率，单因素方差分析比较结果显示，METTL3OE组的细胞凋亡率（0.18 ± 0.01）较其空载对照组METTL3 OENC（0.09 ± 0.01）显著上升，METTL3sh组的细胞凋亡率（0.05 ± 0.01）较其空载对照组（0.09 ± 0.01）下降，P < 0.05。以上结果表明，METTL3过表达可以促进颗粒细胞凋亡，敲低METTL3导致颗粒细胞凋亡率下降，见图10。

图  10  FITC/PI双染法检测颗粒细胞凋亡情况

A： FITC/PI双染法检测颗粒细胞凋亡情况 ；B：两组颗粒细胞凋亡结果。^***P < 0.001，^****P < 0.0001。

Figure  10.  Detection of apoptosis of granulosa cells by FITC/PI double staining method

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2.3.5   CCK-8检测细胞增殖

通过CCK-8检测颗粒细胞在转染慢病毒24 h、48 h、72 h、96 h后的增殖情况，慢病毒转染72 h、96 h，METTL3 OE的细胞增殖活力低于其空载对照METTL3 OENC （P < 0.05）；在慢病毒转染72 h、96 h，METTL3 sh的细胞增殖活力高于其空载对照METTL3 shNC （P < 0.05），见图11。

图  11  CCK-8检测颗粒细胞增殖情况

^*P < 0.05，^**P < 0.01。

Figure  11.  Detection of the proliferation of granulosa cells by CCK-8

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3.   讨论

利用动物模型进行基础研究，是研究人类疾病发生机制的重要手段^[14]。卵巢是女性生殖功能的主要器官，女性维持正常的生理周期和生育能力依赖于卵巢的内分泌功能，卵泡发育过程中任意一个阶段出现问题都会导致POF^[15]。POF动物模型构建方法针对不同病因都有其优势和缺陷，但每种POF动物模型可以高度或部分模拟POF卵巢组织的卵泡减少，促性腺激素上升和雌激素下降等与POF患者相似临床特征^[16-17]。本研究选择D-半乳糖构建POF小鼠模型，全部小鼠均在动情后期采用颈椎脱臼法处死小鼠，发现半乳糖可以导致小鼠出现动情周期紊乱，卵巢组织结构破环，总卵泡数减少，闭锁卵泡增加，并且出现FSH升高，E₂降低等与POF患者类似内分泌变化。这说明研究中选择D-半乳糖代谢法构建POF小鼠模型成功，为后续研究奠定基础。

在建模成功后，笔者通过TUNEL染色检测发现POF组小鼠的卵巢组织中颗粒细胞凋亡水平显著增加。Jiao等^[18]发现颗粒细胞凋亡增加，导致卵泡闭锁，是卵巢功能减低和早发性卵巢功能不全的主要机制一致。同时也有研究表明，颗粒细胞凋亡增加，导致卵泡闭锁增加，从而导致POF的发生^[17]。这就说明了颗粒细胞凋亡是引起POF发生发展的重要机制。

m6A修饰中METTL3是卵巢发育必不可少的，其异常导致卵子成熟障碍和女性不孕^[19]。例如，Mu等^[20]提出METTL3是小鼠卵泡发育所必须的，METTL3对卵子成熟和减数分裂是至关重要的，缺失METTL3导致卵泡发育缺陷和胚胎致死。Xia等^[21]研究发现，METTL3突变导致斑马鱼配子形成障碍，并显著降低斑马鱼的生育力。并且有研究发现环磷酰胺可以导致小鼠颗粒细胞中的METTL3表达上调，并出现卵巢功能减退^[22]。与本研究结果一致，POF组小鼠卵巢组织中的METTL3表达水平较对照组小鼠显著上调。以上结果提示我们，METTL3可能参与POF的发生，其机制可能与调控颗粒细胞凋亡有关。

为证明METTL3调控颗粒细胞凋亡的假设，构建METTL3过表达和敲低慢病及空载对照，转染至小鼠颗粒细胞，通过qRT-PCR和Western blots检测验证METTL3过表达和敲低慢病毒的转染效果。采用CCK-8法检测细胞在转染慢病毒后培养24 h、48 h、72 h、96 h的增殖情况，发现METTL3过表达明显抑制颗粒细胞增殖。FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况，发现过表达METTL3对颗粒细胞凋亡有促进作用。在既往研究中发现，猪卵巢中出现颗粒细胞闭锁时，METTL3表达上调^[23]。与本研究结果一致，说明在颗粒细胞中，METTL3过表达会促进卵巢颗粒细胞凋亡，可能导致卵泡闭锁，从而参与POF的发生。

综上所述，本研究笔者初步探索了METTL3对POF可能的发病机制，即METTL3表达上调，促进颗粒细胞凋亡，导致卵泡闭锁数量增多，最终导致POF的发生。然而，METTL3可能是通过调控凋亡相关下游靶基因，影响RNA的代谢，促进颗粒细胞凋亡，导致闭锁卵泡增加，卵泡池耗竭，进而引起POF，但其具体的分子机制仍需要进一步深入研究。