miR-142-5p Regulates the Proliferation and Metastasis of Gallbladder Carcinoma Cells through CCND1
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摘要:
目的 研究miR-142-5p调控CCND1对胆囊癌细胞增殖和转移的作用，并阐明其具体作用机制。 方法 采用RT-qPCR鉴定miR-142-5p在人胆囊上皮细胞和人胆囊细胞系中的表达差异。双荧光素酶报告基因实验用于验证miR-142-5p与CCND1的靶向关系。CCK-8用于检测人胆囊细胞增殖。Transwell和划痕实验检测胆囊细胞迁移。Western blot检测上皮间充质转化标志蛋白的表达水平。 结果 miR-142-5p在胆囊癌细胞系中显著低表达，且在GBC-SD细胞中表达最低。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-142-5p能够抑制野生型CCND1的荧光素酶活性。 结论 功能试验表明，过表达miR-142-5p抑制GBC-SD细胞的增殖和转移，同时过表达miR-142-5p和CCDN1能够部分逆转过表达CCDN1对GBC-SD细胞增殖和转移的影响。证实miR-142-5p通过抑制CCND1表达，进而抑制胆囊癌细胞的增殖和转移。 -
关键词:
- 胆囊癌 /
- miR-142-5p /
- CCND1 /
- 增殖 /
- 转移
Abstract:Objective To explore the effect of miR-142-5p on the proliferation and metastasis of gallbladder cancer through CCND1 and to clarify the special mechanism of action. Methods RT-qPCR was performed to identify the differential expression of miR-142-5p in human gallbladder epithelial cells HGBEC and human gallbladder cell lines. Dual luciferase reporter gene assay was used to verify the targeting relationship between miR-142-5p and CCND1. CCK-8 was used for detecting human gallbladder cell proliferation. Transwell and wound healing assays were carried out to detect gallbladder cell migration. Western blot was performed to detect the marker expression of epithelial mesenchymal transition. Results miR-142-5p was significantly low expressed in gallbladder cancer cell lines, and lowest expressed in GBC-SD cells. Dual luciferase reporter gene assays revealed that miR-142-5p was able to inhibit the luciferase activity of wild-type CCND1. Conclusion Overexpressing of miR-142-5p inhibited the proliferation and metastasis of GBC-SD cells, simultaneous overexpression of miR-142-5p and CCDN1 partially reversed the effect of overexpressing CCDN1 on the proliferation and metastasis of GBC-SD cells. We demonstrate that miR-142-5p can inhibit the proliferation and metastasis of gallbladder cancer cells by suppressing CCND1 expression. -
Key words:
- Gallbladder /
- miR-142-5 p /
- CCND1 /
- Proliferation /
- Metastasis
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胆囊癌（gallbladder carcinoma，GBC）是高侵袭性的胆道系统恶性肿瘤，占胆道恶性肿瘤的80%～95%[1]。GBC的发病率在世界不同的地理区域之间有显著差异，南美洲和亚洲国家报道的发病率相对较高[2-3]。由于早期缺乏显著的临床特征，90%以上的GBC患者确诊时已经是晚期，使得这这些患者无法得到及时有效的治疗，预后较差。因此，识别可能作为GBC患者新的诊断生物标志物和治疗靶点的新因素至关重要。miRNA是内源性非编码RNA，通过mRNA降解或转录后水平的翻译抑制对基因的表达进行负调控。研究表明，miRNA的调控异常可能会影响其下游基因的表达，进而导致正常生物学过程中断以及包括肿瘤在内的多种疾病的发生与发展[4]。miR-142已被报道在癌症[5]、病毒感染[6]、炎症[7]以及免疫耐受[8]中发挥重要作用，miR-142-5p是miR-142的滞后链。Wang等[9]证实，miR-142-5p在胆囊癌中表达降低，但目前关于miR-142-5p调控胆囊癌的具体机制尚不清楚。因此，本研究主要探讨miR-142-5p通过调控其下游基因对胆囊癌发展的作用机制。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验细胞
人胆囊上皮细胞HGBEC（货号：HTX3131）购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。人胆囊癌细胞系GBC-SD（货号：CL0085）、NOZ（CL-0581）以及人胚肾细胞293T（货号：CL-0005）购自武汉普诺赛生命科技有限公司，SGC-996（货号：YS490C）、EH-GB1（货号：YS3570C）购自上海雅吉生物科技有限公司。
1.1.2 主要试剂
DMEM培养基、RPMI-1640培养基、青霉素-链霉素溶液购自武汉普诺赛生命科技有限公司；Williams'E培养基购自Thermo Fisher（美国）。pcDNA质粒于上海酶研生物科技有限公司。总RNA提取试剂盒、CCK-8试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。Taqman MicroRNA逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司。抗E-cadherin（1∶10000）、抗N-cadherin（1∶5000）、抗Vimentin（1∶5000）、抗CCND1（1∶10000）抗体、羊抗兔二抗购自英国Abcam。RIPA蛋白裂解液、购自上海碧云天生物科技有限公司。Transwell小室购自买美国corning。psiCHECK-2载体购自美国Promega。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
293T接种在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM培养基内。HGBEC、GBC-SD、SGC-996细胞分别培养在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基。NOZ细胞培养在含10% FBS、1% 青霉素-链霉素溶液的Williams’ E培养基中；EH-GB1细胞培养在含15% FBS的DMEM培养基中。随后，将各培养基置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
1.2.2 细胞转染
取生长良好的GBC-SD细胞，根据Lipofectamine 3000试剂盒说明书，将NC mimics、miR-142-5p mimics、pcDNA-NCmiR-142-5p mimics+pcDNA-CCND1分别转染至GBC-SD细胞。转染48 h后通过RT-qPCR或Western blot检测转染效率，转染成功后进行后续实验。
1.2.3 RT-qPCR检测miR-142-5p的表达
根据试剂说明，使用Trizol试剂从GBC-SD细胞中共提取了总RNA。为了检测miR-142-5p的表达水平，使用Taqman MicroRNA逆转录试剂盒将1 μg RNA样本逆转录为互补DNA（cDNA）。使用Taqman Universal Master Mix II和TaqMan microRNA检测GBC-SD细胞中miR-142-5p的表达水平。U6作为内部对照。用2-ΔΔCT法计算miR-142-5p的相对表达量比值。miR-142-5p的引物序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequences基因 引物序列（F：Forward primer；R：Reversed primer；5′ -3′ ） miR-142-5p F: AACTCCAGCTGGTCCTTAG R: TCTTGAACCCTCATCCTGT U6 F: CTCGCTTCGGCAGCACA R: AACGCTTCACGAATTTGCGT 1.2.4 Western blot检测CCND1以及上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）标志物的表达
Western blot检测CCND1和EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平。将转染后的各组GBC-SD细胞用RIPA试剂充分裂解细胞，采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白质浓度和纯度。随后，将40 μg蛋白样品经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，经PVDF转膜，在5%脱脂牛奶中室温封闭，1 h后取出膜并与一抗（E-cadherin 1∶10000）、N-cadherin 1∶5000、Vimentin 1∶5000、CCND1 1∶10000）在4℃条件下过夜孵育。用PBS洗膜3次，每次5 min，在将膜与羊抗兔二抗在室温下孵育2 h。经PBS洗膜后将膜置于ECL化学发光试剂溶液中孵育5 min。取出膜后擦净多余液体后放入暗室中曝光。Image J软件分析蛋白条带灰度值。
1.2.5 CCK-8检测细胞增殖活力
在对数生长期采集各组GBC-SD细胞样本，制成细胞悬液，以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔板中培养。在适当时间（0、24、48 h）加入10 μL CCK-8检测液后，培养皿中放置4 h，用微孔板阅读器检测450 nm处吸光度值。
1.2.6 Transwell检测细胞侵袭
使用孔径为8 μm的Transwell分析法检测细胞侵袭。将Matrigel基质胶平铺在24孔Transwell培养室的上部隔室中，静置使其凝固。用PBS洗涤细胞两次，然后在无血清培养基中重新悬浮，并将细胞密度调节至1×105。然后，将总计200 μL细胞悬液添加到Matrigel基质胶上。下部隔室中装有600 μL的完全培养基。在37 ℃下培养24 h后，用湿棉签擦拭上部隔室中的未侵袭的细胞。将过滤器下侧的细胞在甲醇中固定30 min。然后用0.5%结晶紫对这些细胞染色20 min，并进行显微镜计数。
1.2.7 划痕实验检测细胞迁移
将2×105个细胞/孔接种至12孔板中，孵育24 h。用移液枪枪头划痕，用PBS洗涤细胞3次，取出划下的细胞。将细胞在RPMI-1640培养基中培养，分别在划痕后的第0、12、24 h拍摄细胞。通过公式计算细胞迁移面积：迁移面积=（A0-An）/A0×100%，其中A0为初始创面面积，An为测量时间点剩余创面面积。
1.2.8 双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-5p和CCND1的靶向关系
将CCND1的3’UTR扩增到psiCHECK-2载体中，构建CCND1野生型（Wild type，WT）载体CCND1-WT。将与miR-142-5p靶向结合的CCND1序列突变，构建CCND1突变型（Mutant）载体CCND1-MUT。将293T细胞接种至96孔板中，每孔1×104个细胞，12 h后，将NC mimics、miR-142-5p mimics以及CCND1-WT/MUT报告基因载体共转染至293T细胞中，在继续培养24 h。通过Reporter Assay System Kit测量荧光素酶活性，并计算相对荧光素酶活性，即萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。
1.3 统计学处理
采用GraphPad Prism 8.0进行数据分析并绘制图片，数据结果表示为“平均数±标准差”（mean ± SD）。t检验用于两组间的比较，单因素方差分析用于多组间的比较。以P < 0.05表差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 miR-142-5p在胆囊癌细胞系中表达降低
采用RT-qPCR检测人胆囊上皮细胞HGBEC和人胆囊癌细胞系GBC-SD、NOZ、SGC-996、EH-GB1中miR-142-5p的表达，结果见图1，miR-142-5p在胆囊癌细胞系中的表达明显低于HGBEC，且差异具有统计学意义（P < 0.001）。且在GBC-SD细胞中的表达明显低于其他细胞系（P < 0.05），因此，我们选择GBC-SD细胞进行后续实验。
图 1 miR-142-5p在胆囊癌细胞系中表达降低与HGBEC组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与GBC-SD组相比，△P < 0.05。Figure 1. The expression of miR-142-5p decreased in gallbladder cancer cell line.2.2 过表达miR-142-5p抑制GBC-SD细胞的增殖和转移
笔者分别在GBC-SD细胞中转染NC mimics和miR-142-5p mimics，通过RT-qPCR检测转染效率，结果显示，转染miR-142-5p可显著上调GBC-SD细胞中miR-142-5p的表达（P < 0.01，图2A），表明已成功转染miR-142-5p mimics。随后，笔者通过CCK-8、Transwell以及划痕实验检测细胞的增殖、侵袭和迁移能力，发现过表达miR-142-5p组细胞的增殖活力（P < 0.01，图2B）、侵袭（P < 0.01，图2C和E）和迁移能力（P < 0.05，图2D和F）与NC mimics组相比显著降低。Western blot检测发现，相比较于NC mimics组，过表达miR-142-5p可促进E-cadherin表达（P < 0.01，图2G），抑制N-cadherin和Vimentin的表达（均P < 0.01）。综上可知，过表达miR-142-5p可显著抑制GBC-SD细胞增殖和转移。
图 2 过表达miR-142-5p抑制GBC-SD细胞的增殖和转移A：RT-qPCR检测miR-142-5p mimics转染效率；B：CCK-8检测细胞增殖活力；C和E：Transwell检测细胞侵袭能力；D和F：划痕实验检测细胞迁移能力；G：Western blot检测细胞EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达；与NC mimics组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。Figure 2. Overexpression of miR-142-5p inhibited the proliferation and metastasis of GBC-SD cells2.3 miR-142-5p靶向CCND1
笔者通过starBase生信数据库预测miR-142-5p的潜在靶基因，发现CCND1与miR-142-5存在靶向结合序列，图3A。双荧光素酶报告基因实验表明，与NC mimics组相比，过表达miR-142-5p mimics可显著抑制CCND1野生型质粒的荧光素酶活性（P < 0.01，图3B），而对突变型质粒的荧光素酶活性的作用与NC mimics组相比无明显差异。笔者通过Western blot检测CCND1在胆囊上皮细胞HGBEC和胆囊癌细胞GBC-SD中的表达，与HGBEC组相比，CCND1在GBC-SD中的表达明显升高（P < 0.01，图3C和E）。进一步通过Western blot检测过表达miR-142-5p对CCND1表达的影响，结果表明过表达miR-142-5p组中CCND1的表达明显低于NC mimics组（P < 0.01，图3D和F）。这些结果显示，在GBC-SD细胞中，miR-142-5p靶向负调控CCND1。
图 3 miR-142-5p靶向CCND1A：starBase生信数据库预测miR-142-5p与CCND1的靶向结合序列；B：双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-5p和CCND1的靶向关系，与NC mimics组相比，**P < 0.01；C和E：Western blot检测HGBEC和GBC-SD细胞中CCND1的表达，与HGBEC组相比，**P < 0.01；D和F：Western blot检测过表达miR-142-5p对CCND1表达的影响，与NC mimics组相比，**P < 0.01。Figure 3. miR-142-5p targeted CCND12.4 miR-142-5p靶向CCND1抑制GBC-SD细胞的增殖和转移
笔者在GBC-SD细胞中分别转染pcDNA-NC+NC mimics、pcDNA-CCND1+NC mimics和pcDNA-CCND1+miR-142-5p mimics，通过Western blot检测细胞中CCND1的表达，见图4A，与pcDNA-NC+NC mimics组相比，转染pcDNA-CCND1可显著上调CCND1的表达（P < 0.05），同时过表达miR-142-5p和CCND1可逆转过表达CCND1对CCND1表达的促进作用（P < 0.01）。CCK-8、Transwell和划痕实验检测发现，与pcDNA-NC+NC mimics组相比，pcDNA-CCND1+NC mimics组中细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显增加，pcDNA-CCND1+miR-142-5p mimics组中细胞的增殖（P < 0.05，图4B）、侵袭（P < 0.01，图4C和D）和迁移（P < 0.01，图4E和F）能力明显低于pcDNA-CCND1+NC mimics组。通过Western blot检测各组EMT标志物的表达，结果证实，相比较于pcDNA-NC+NC mimics组，pcDNA-CCND1+NC mimics组中E-cadherin表达降低（P < 0.01，图4G），N-cadherin和Vimentin的表达升高（P < 0.01），过表达miR-142-5p可逆转过表达CCND1对E-cadherin表达的抑制以及对N-cadherin和Vimentin的表达的促进作用。综上所述，过表达miR-142-5p靶向下调CCND1，抑制GBC-SD细胞增殖和转移。
图 4 miR-142-5p靶向CCND1抑制GBC-SD细胞的增殖和转移A：Western blot检测CCND1的表达；B：CCK-8检测细胞增殖活力；C和D：Transwell检测细胞侵袭；E和F：划痕实验检测细胞迁移；G：Western blot检测细胞EMT标志物的表达；与pcDNA-NC+NC mimics组相比，*P < 0.05，**P < 0.01；与pcDNA-CCND1+NC mimics组相比，△P < 0.05，△△P < 0.01，△△△P < 0.001。Figure 4. miR-142-5p inhibited cell proliferation and metastasis of GBC-SD cells by targeting CCND1.3. 讨论
GBC是胆道常见的恶性肿瘤之一，由于患者转移早、确诊晚、预后差，5 a生存率低于5%[10]，严重威胁着世界各国人民的生命健康。寻找有效的检测和治疗方法是目前防治GBC的重点和难点。
最近的研究报道，miRNA参与了GBC的发展过程，miRNA的失调在GBC的肿瘤发生过程中起着至关重要的作用[11-13]。Chen等[14]报道，miR-575在胆囊癌中高表达，敲降miR-575可降低GBC细胞的增殖和侵袭能力，诱导G1期阻滞和细胞吊凋亡，且miR-575靶向负调控p27Kpi1抑制GBC的肿瘤生长；miR-122在GBC组织和细胞系中表达降低，过表达miR-122靶向下调PKM2抑制TGF-β诱导的GBC细胞EMT[15]；Gong等[16]证实，与癌旁组织相比，miR-1231在GBC组织中下调，低表达的miR-1231的GBC患者肿瘤分期较差，过表达amiR-1231可降低细胞增殖活力，诱导GBC细胞凋亡，提高GBC细胞的多西他赛化疗敏感性。我们的研究表明，miR-142-5p在GBC细胞系中显著低表达。进一步通过实验证实，过表达miR-142-5p可显著抑制GBC-SD细胞的增殖、侵袭和迁移以及EMT。这Wang与[9]等报道的miR-142-5p在GBC组织中表达降低一致。此外，有报道称，miR-142-5p结直肠癌中低表达，可作为肿瘤抑制因子抑制结直肠癌的发展[17]；在非小细胞肺癌组织和细胞系，miR-142-5p表达降低，过表达miR-142-5p可抑制非小细胞肺癌细胞在体内和体外的增殖[18]。
细胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）位于第11q13号染色体上，可作为细胞周期调节蛋白，介导G1-S期的相变。越来越多的研究证实，CCND1与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关，例如：CCND1被miR-584直接靶向，促进胰腺癌的增殖和侵袭[19]；LncRNA LOXL1-AS1通过海绵作用miR-541-3p，提高CCND1的表达，从而加速前列腺癌进展[20]；乳腺癌细胞中CCND1高表达，可作为miR-93的靶基因，过表达CCND1可逆转过表达miR-93对人乳腺癌细胞增殖的抑制作用以及对G1/S细胞周期阻滞和紫杉醇耐药的敏感性的诱导作用。在本研究中，笔者发现miR-142-5p可直接靶向CCND1，抑制GBC-SD细胞中CCND1蛋白的表达。过表达miR-142-5p可逆转过表达CCND1对GBC-SD细胞增殖、侵袭和迁移的促进作用。总而言之，过表达miR-142-5p可靶向下调CCND1，抑制GBC细胞的增殖和转移。
综上所述，笔者证实，miR-142-5p在GBC细胞系中低表达，过表达miR-142-5p通过靶向下调CCND1，抑制GBC-SD细胞的增殖和转移，以期为GBC临床诊断提供理论依据。
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图 1 miR-142-5p在胆囊癌细胞系中表达降低
与HGBEC组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与GBC-SD组相比，△P < 0.05。
Figure 1. The expression of miR-142-5p decreased in gallbladder cancer cell line.
图 2 过表达miR-142-5p抑制GBC-SD细胞的增殖和转移
A：RT-qPCR检测miR-142-5p mimics转染效率；B：CCK-8检测细胞增殖活力；C和E：Transwell检测细胞侵袭能力；D和F：划痕实验检测细胞迁移能力；G：Western blot检测细胞EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达；与NC mimics组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 2. Overexpression of miR-142-5p inhibited the proliferation and metastasis of GBC-SD cells
图 3 miR-142-5p靶向CCND1
A：starBase生信数据库预测miR-142-5p与CCND1的靶向结合序列；B：双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-5p和CCND1的靶向关系，与NC mimics组相比，**P < 0.01；C和E：Western blot检测HGBEC和GBC-SD细胞中CCND1的表达，与HGBEC组相比，**P < 0.01；D和F：Western blot检测过表达miR-142-5p对CCND1表达的影响，与NC mimics组相比，**P < 0.01。
Figure 3. miR-142-5p targeted CCND1
图 4 miR-142-5p靶向CCND1抑制GBC-SD细胞的增殖和转移
A：Western blot检测CCND1的表达；B：CCK-8检测细胞增殖活力；C和D：Transwell检测细胞侵袭；E和F：划痕实验检测细胞迁移；G：Western blot检测细胞EMT标志物的表达；与pcDNA-NC+NC mimics组相比，*P < 0.05，**P < 0.01；与pcDNA-CCND1+NC mimics组相比，△P < 0.05，△△P < 0.01，△△△P < 0.001。
Figure 4. miR-142-5p inhibited cell proliferation and metastasis of GBC-SD cells by targeting CCND1.
表 1 引物序列
Table 1. Primer sequences
基因 引物序列（F：Forward primer；R：Reversed primer；5′ -3′ ） miR-142-5p F: AACTCCAGCTGGTCCTTAG R: TCTTGAACCCTCATCCTGT U6 F: CTCGCTTCGGCAGCACA R: AACGCTTCACGAATTTGCGT 
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