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miR-142-5p通过CCND1调控胆囊癌细胞的增殖和转移

王保全 张伟 田园 雷喜锋 王旭

王保全, 张伟, 田园, 雷喜锋, 王旭. miR-142-5p通过CCND1调控胆囊癌细胞的增殖和转移[J]. 昆明医科大学学报, 2022, 43(2): 47-53. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220223
引用本文: 王保全, 张伟, 田园, 雷喜锋, 王旭. miR-142-5p通过CCND1调控胆囊癌细胞的增殖和转移[J]. 昆明医科大学学报, 2022, 43(2): 47-53. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220223
Baoquan WANG, Wei ZHANG, Yuan TIAN, Xifeng LEI, Xu WANG. miR-142-5p Regulates the Proliferation and Metastasis of Gallbladder Carcinoma Cells through CCND1[J]. Journal of Kunming Medical University, 2022, 43(2): 47-53. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220223
Citation: Baoquan WANG, Wei ZHANG, Yuan TIAN, Xifeng LEI, Xu WANG. miR-142-5p Regulates the Proliferation and Metastasis of Gallbladder Carcinoma Cells through CCND1[J]. Journal of Kunming Medical University, 2022, 43(2): 47-53. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220223

miR-142-5p通过CCND1调控胆囊癌细胞的增殖和转移

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220223
基金项目: 陕西省青年基金资助项目(81001669)
详细信息
    作者简介:

    王保全(1972~),男,陕西渭南人,学士,副主任医师,主要从事胃肠肿瘤的临床治疗

    通讯作者:

    王旭,E-mail:wangxu2600@163.com

  • 中图分类号: R735.8[

miR-142-5p Regulates the Proliferation and Metastasis of Gallbladder Carcinoma Cells through CCND1

  • 摘要:   目的  研究miR-142-5p调控CCND1对胆囊癌细胞增殖和转移的作用,并阐明其具体作用机制。  方法  采用RT-qPCR鉴定miR-142-5p在人胆囊上皮细胞和人胆囊细胞系中的表达差异。双荧光素酶报告基因实验用于验证miR-142-5p与CCND1的靶向关系。CCK-8用于检测人胆囊细胞增殖。Transwell和划痕实验检测胆囊细胞迁移。Western blot检测上皮间充质转化标志蛋白的表达水平。  结果  miR-142-5p在胆囊癌细胞系中显著低表达,且在GBC-SD细胞中表达最低。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-142-5p能够抑制野生型CCND1的荧光素酶活性。  结论  功能试验表明,过表达miR-142-5p抑制GBC-SD细胞的增殖和转移,同时过表达miR-142-5p和CCDN1能够部分逆转过表达CCDN1对GBC-SD细胞增殖和转移的影响。证实miR-142-5p通过抑制CCND1表达,进而抑制胆囊癌细胞的增殖和转移。
  • 随着生育政策及社会经济形态的转变,高龄产妇(年龄≥35岁)数量日益增多。在妊娠及分娩过程中易损伤到盆底结构及功能,患盆底功能障碍性疾病(pelvic fIoor dysfunction,PFD)风险较高。诸多研究发现[1-2],高龄产妇产后患盆底疾病风险远高于适龄产妇,且影响因素较多,一旦发生势必会对产妇生活质量造成严重影响,应给予高度重视。早期评估诊断盆底功能及结构变化对于预防及降低PFD疾病发生有着重要意义。盆底超声为评估PFD疾病的主要辅助检查技术之一,具有安全无创等优势。二维超声[3]、三维超声[4]为临床常用盆底超声技术,可量化评估观察盆底解剖结构形态学变化情况。但由于盆底结构较为复杂,误诊漏诊风险较高,仍需对超声技术诊断效能作进一步明确。基于此,本研究将对比盆底二维,三维超声评估适龄、高龄产妇产后早期盆底结构及功能的变化,旨在明确盆底超声诊断效能,为临床精准诊疗提供参考依据,现报道如下。

    选择本院2021年7月至2022年12月就诊的产后早期(6~8周)高龄产妇86例作为观察组,选择同期就诊的产后早期适龄产妇50例作为对照组。观察组年龄35~43岁(38.67±4.35)岁;BMI(24.14±2.58)kg/m2;孕次0~3次(1.38±0.14)次,人工流产史6例;对照组年龄22~34岁(27.15±4.21)岁;BMI(23.97±2.64)kg/m2;孕次0~3次(1.29±0.18)次,人工流产史5例。两组除年龄资料以外各项资料进行匹配,差异无统计学意义(P > 0.05)。

    纳入标准:(1)符合盆底超声诊断适应证[5];(2)高龄产妇年龄≥35岁;(3)单胎妊娠、足月、阴道自然分娩;(4)患者家属签署知情同意书。

    排除标准:(1)妊娠前存在PFD疾病;(2)存在妊娠合并症、产后大出血、持续恶露、泌尿系统炎症者;(3)既往有盆腔手术史、占位性病变者;(4)产后接受盆底功能恢复治疗者。

    所有研究对象均接受盆底二维、三维超声诊断,所有操作均由同一位超声科医生完成。仪器选择:GE Voluson E10彩色多普勒超声诊断仪,并配备经阴道探头RM6C-D及编码对比成像软件。具体操作如下:叮嘱产妇排空大便,并保持膀胱适度充盈,选择截石体位,保持髋部微曲及轻度外展,充分暴露会阴部。检查者采用耦合剂均匀涂抹于探头表面上,并采用安全套包裹,将探头轻柔置入阴道,对其子宫双附件进行检查后,将其放置于受检者会阴部。首先进行二维超声扫描,选择盆底正中矢状切面(显示膀胱颈、膀胱、尿道、耻骨联合前下缘、后间隙等结构)进行扫描,观察盆底器官位置及运动情况,并于静息状态、Valsalva动作(深吸气后屏气向下用力,持续6 s)下测量膀胱颈位置(bladder neck position,BNP)、膀胱尿道后角(posterior urethravesical angel,PUA),并计算膀胱颈移动度(bladder neck descent,BND)、尿道旋转角(urethral rotation angel,URA)。接着开启三维超声扫描,进行盆底正中矢状切面、肛管横切面扫查(显示耻骨、直肠、尿道、阴道、肛门括约肌、肛提肌等结构),获取肛提肌裂孔图像,测量静息状态、Valsalva动作下肛提肌裂孔前后径 ( levator hiatal anteroposterior diameter,LHAP)、肛提肌裂孔左右径(levator hiatal lateral diameter,LHLP)、肛提肌裂孔面积(levator hiatal area,LHA)。

    (1)对比2组产妇盆底二维超声评估参数;(2)对比2组产妇盆底三维超声评估参数;(3)对比盆底二维、三维超声对适龄、高龄产妇产后PFD的诊断效能:以PFD疾病相关权威指南诊断标准(盆腔脏器脱垂[6]、压力性尿失禁等)为金标准,患PFD为阳性,未患为阴性,计算两种技术诊断灵敏度(真阳性/(真阳性+假阴性))、特异度(真阴性/(真阴性+假阳性))及准确性((真阳性+真阴性)/总样本数);(4)盆底二维、三维超声诊断图像。

    将数据纳入SPSS23.0软件中分析,计量资料(盆底二维、三维超声评估参数)比较采用t检验,并以($\bar x \pm s$)表示,计数资料(诊断效能)采用χ2检验,并以率(%)表示,(P < 0.05)为差异有统计学意义。

    观察组静息状态BNP、PUA、Valsalva动作BNP水平、BND水平明显高于对照组(P < 0.05);而Valsalva动作PUA及URA水平对比差异无统计学意义(P > 0.05),见表1

    表  1  盆底二维、三维超声对适龄产妇产后PFD的诊断效能比较(n)
    Table  1.  Comparison of the diagnostic efficacy of two-dimensional and three-dimensional ultrasound (n)
    诊断技术金标准灵敏度(%)特异度(%)准确性(%)
    阳性阴性合计
    二维超声 阳性 7 3 10 77.78(7/9)
    92.68(38/41)
    90.00(45/50)
    阴性 2 38 40
    合计 9 41 50
    三维超声 阳性 8 1 9 88.89(8/9) 97.56(40/41) 96.00(48/50)
    阴性 1 40 41
    合计 9 41 50
    χ2 0.400 1.051 1.383
    P 0.527 0.305 0.240
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    观察组Valsalva动作LHAP、LHLP、LHA水平均明显高于对照组(P < 0.05);而静息状态LHAP、LHLP、LHA水平对比差异无统计学意义(P > 0.05),见表2

    表  2  2组产妇盆底二维超声评估参数比较($ \bar x \pm s $
    Table  2.  Comparison of the two groups of puerpera pelvic floor two-dimensional ultrasound evaluation parameter between the two groups ($ \bar x \pm s $
    组别n静息状态 Valsalva动作BND(cm)URA(°)
    BNP(cm)PUA(°) BNP(cm)PUA(°)
    观察组 86 −2.34 ± 0.47* 120.47 ± 25.34* −0.59 ± 0.23* 137.45 ± 24.32 1.75 ± 0.35* 30.78 ± 6.53
    对照组 50 −3.11 ± 0.56 104.68 ± 20.15 −1.74 ± 0.39 139.54 ± 25.47 1.37 ± 0.44 29.45 ± 5.84
    t 8.577 3.766 21.654 0.475 5.545 1.190
    P <0.001 <0.001 <0.001 0.636 <0.001 0.236
      与对照组比较,*P < 0.05。
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    50例适龄产妇中PFD患者9例,膀胱脱垂5例,压力性尿失禁4例,及阴道、直肠脱垂。盆底二维、三维对比无差异(P > 0.05)。86例高龄产妇中PFD患者27例,其中盆底脱垂15例,压力性尿失禁12例。盆底三维超声诊断灵敏度(92.59%)、准确性(91.53%)明显高于二维超声(70.37%、77.91%),P < 0.05,见表3表4

    表  3  2组产妇盆底三维超声评估参数比较($ \bar x \pm s $
    Table  3.  Comparison of pelvic floor three-dimensional ultrasound evaluation parameters between the two groups ($ \bar x \pm s $
    组别n静息状态Valsalva动作
    LHAP(cm)LHLP(cm)LHA(cm2LHAP(cm)LHLP(cm)LHA(cm2
    观察组 86 5.45 ± 1.26 3.01 ± 0.84 16.41 ± 2.54 6.07 ± 1.34* 4.16 ± 1.22* 25.25 ± 2.76*
    对照组 50 5.12 ± 1.23 3.07 ± 0.58 15.72 ± 2.36 5.54 ± 1.25 3.73 ± 0.85 20.66 ± 2.52
    t 1.486 0.447 1.567 2.279 2.200 9.649
    P 0.140 0.656 0.119 0.024 0.030 <0.001
      与对照组比较,*P < 0.05。
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    表  4  盆底二维、三维超声对高龄产妇产后PFD的诊断效能比较(n)
    Table  4.  Comparison of the diagnostic effcacy of two-dimensional and three-dimensional ultrasound of pelvic floor for PFD in older women (n)
    诊断技术金标准灵敏度(%)特异度(%)准确性(%)
    阳性阴性合计
    二维超声 阳性 19 11 30 70.37(19/27) 70.37(48/59) 77.91(67/86)
    阴性 8 48 56
    合计 27 59 86
    三维超声 阳性 25 5 30 92.59(25/27) 91.53(54/59) 91.86(79/86)
    阴性 2 54 56
    合计 27 59 86
    χ2 4.418 2.603 6.525
    P 0.036 0.107 0.011
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    适龄、高龄产妇患者盆底二维、三维超声诊断图像分别见图1图2,其中A为静息状态下盆底正中矢状切面;B为Valsalva动作下盆底正中矢状切面;C为断层成像模式观察肛提肌连续性,层间距2.5 mm(中间3幅图依次显示耻骨联合开放、正在关闭、已关闭状态;D为肛提肌裂孔;E为断层成像模式观察肛门括约肌连续性,其中左侧为肛门内括约肌下缘,右侧为外括约肌上缘。

    图  1  适龄产妇
    A:静息状态下盆底正中矢状切面;B:Valsalva动作下盆底正中矢状切面;C:肛提肌;D:肛提肌裂孔;E:肛门括约肌。
    Figure  1.  Image of maternal age women
    图  2  高龄产妇
    A:静息状态下盆底正中矢状切面;B:Valsalva动作下盆底正中矢状切面;C:肛提肌;D:肛提肌裂孔;E:肛门括约肌。
    Figure  2.  Image of elderly parturient women

    妊娠及分娩为引起女性盆底结构及功能损伤的主要因素,妊娠期间由于子宫体积增长,机体为适应妊娠会出现支持盆腔器官组织过度延伸,达到一定程度时将肌肉将可能丧失收缩恢复能力;分娩过程中阴道周围支持组织受到牵拉、扩张,甚或肌肉纤维断裂,继而导致盆底肌损伤。而进行产后盆底功能检测对于PFD早期诊断及预防有着重要意义。盆底超声为临床产后检查评估盆底结构主要技术,可观察盆底解剖结构形态学变化,继而评估其组织功能状态,为临床诊治及疗效评估提供客观依据。二维经阴道超声是评估的主要筛查工具,具有简单、可重复性、成像清晰等特征,可用于评估膀胱、膀胱颈、尿道等组织形态变化,辅助盆底功能及结构评估[7-9]。三维超声具有较高空间分辨率,可通过多平面成像及图像重建后处理,为临床评估盆底结构及功能提供可靠数据[10-12]

    本研究显示,观察组静息状态BNP、PUA、Valsalva动作BNP水平、BND水平明显高于对照组(P < 0.05);而Valsalva动作PUA及URA水平对比差异无统计学意义(P > 0.05)。观察组Valsalva动作LHAP、LHLP、LHA水平均明显高于对照组(P < 0.05);而静息状态LHAP、LHLP、LHA水平对比差异无统计学意义(P > 0.05)。说明相较于适龄产妇,高龄产妇产后早期更易出现肛提肌、膀胱等盆底组织功能及结构变化,适龄产妇变化不大。李宁等[13]研究报道,高龄产妇的Valsalva动作LHA水平高于适龄产妇,该结果与本研究结果一致。其原因在于相较于适龄产妇,高龄产妇的生理功能出现逐步下降,尤其是盆底肌群收缩反应时间延长,速度减慢,盆底肌肉、神经长时间处于压迫状态,出现盆底组织损伤概率较高;此外盆底肌肉组织中胶原、弹性蛋白含量降低,无法维持正常收缩功能,出现超声异常征象。盆底三维超声诊断灵敏度、准确性明显高于二维超声。此处已删减研究报道,孕妇的盆底肌肉不仅受到与分娩相关的机械损伤的影响,还受到怀孕期间生理变化的影响,继而使得提肌裂孔增大[14]。其原因在于虽然二维超声可以全面评估显示盆底结构,但该技术无法显示示肛提肌、盆膈裂孔等结构,而三维超声可通过多平面成像及图像重建后处理,更加准确、立体显示盆底结构组织及结构变化,该技术对于测量肛提肌裂孔各参数有着较高精确度,其中肛提肌裂孔可进一步反映肛提肌顺应性,继而提高临床诊断效能[15]

    综上所述,高龄产妇产后早期更易出现盆底功能及结构变化,相较于二维超声,盆底三维超声更有助于提高PFD诊断效能。

  • 图  1  miR-142-5p在胆囊癌细胞系中表达降低

    与HGBEC组相比,**P < 0.01,***P < 0.001;与GBC-SD组相比,P < 0.05。

    Figure  1.  The expression of miR-142-5p decreased in gallbladder cancer cell line.

    图  2  过表达miR-142-5p抑制GBC-SD细胞的增殖和转移

    A:RT-qPCR检测miR-142-5p mimics转染效率;B:CCK-8检测细胞增殖活力;C和E:Transwell检测细胞侵袭能力;D和F:划痕实验检测细胞迁移能力;G:Western blot检测细胞EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达;与NC mimics组相比,*P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001。

    Figure  2.  Overexpression of miR-142-5p inhibited the proliferation and metastasis of GBC-SD cells

    图  3  miR-142-5p靶向CCND1

    A:starBase生信数据库预测miR-142-5p与CCND1的靶向结合序列;B:双荧光素酶报告基因实验验证miR-142-5p和CCND1的靶向关系,与NC mimics组相比,**P < 0.01;C和E:Western blot检测HGBEC和GBC-SD细胞中CCND1的表达,与HGBEC组相比,**P < 0.01;D和F:Western blot检测过表达miR-142-5p对CCND1表达的影响,与NC mimics组相比,**P < 0.01。

    Figure  3.  miR-142-5p targeted CCND1

    图  4  miR-142-5p靶向CCND1抑制GBC-SD细胞的增殖和转移

    A:Western blot检测CCND1的表达;B:CCK-8检测细胞增殖活力;C和D:Transwell检测细胞侵袭;E和F:划痕实验检测细胞迁移;G:Western blot检测细胞EMT标志物的表达;与pcDNA-NC+NC mimics组相比,*P < 0.05,**P < 0.01;与pcDNA-CCND1+NC mimics组相比,P < 0.05,△△P < 0.01,△△△P < 0.001。

    Figure  4.  miR-142-5p inhibited cell proliferation and metastasis of GBC-SD cells by targeting CCND1.

    表  1  引物序列

    Table  1.   Primer sequences

    基因引物序列(F:Forward primer;R:Reversed primer;5′ -3′ )
    miR-142-5p F: AACTCCAGCTGGTCCTTAG
    R: TCTTGAACCCTCATCCTGT
    U6 F: CTCGCTTCGGCAGCACA
    R: AACGCTTCACGAATTTGCGT
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    [6] 徐冬杏, 唐波, 朱国, 雷学芬, 王秋虹, 魏东.  Twist1调控Bmi1对胆囊癌细胞侵袭迁移的影响及其机制研究, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230320
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    [8] 张梁, 王保全, 雷喜锋, 王旭, 柯阳, 张玮.  miR-29c-3p/IGF1分子轴对肝星状细胞活化,增殖和凋亡的作用机制, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230926
    [9] 冯毅, 王小峰, 白西民, 姚胜, 党俊涛, 赵云洁, 蔡冰.  miR-149-5p通过MSH5/Wnt信号通路调控胶质瘤细胞恶性生物学行为, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230823
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    [11] 廖周俊, 杨少华, 刘立鑫, 胡晟, 陈轶晖, 康强, 张小文.  AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移的影响, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220611
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-12-20
  • 网络出版日期:  2022-02-24
  • 刊出日期:  2022-03-04

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