Effects of Scutellarin on Expressions of PKC and TNF-α in OX-LDL Injured RAW264.7 Cells in vitro
-
摘要:
目的 研究灯盏乙素（scutellarin）对OX-LDL诱导损伤的巨噬细胞RAW264.7脂质吞噬能力及对PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达调控的影响。 方法 体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，复制OX-LDL诱导损伤模型，通过油红O染色检测脂质吞噬及试剂盒检测细胞损伤模型胆固醇酯的含量。Western blot和RT-PCR方法检测RAW264.7细胞中PKC和TNF-α表达变化。 结果（ 1） 油红O结果显示：与正常对照组比较，模型组细胞红染程度明显高于正常对照组；与模型组比较，辛伐他汀组、灯盏乙素50和100 μmol /L组细胞红染程度均低于模型组;（ 2）胆固醇酯含量检测显示:与正常对照组比较，各时间点模型组细胞CE/TC值均明显升高；与模型组比较，各时间点用药组细胞CE/TC值均降低。（ 3） WB和RT-PCR结果显示：与正常对照组比较，模型组PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达升高；与模型组比较，辛伐他汀组(simvastatin) PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达降低，且灯盏乙素组呈浓度依赖性下调PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达。 结论 （1）灯盏乙素能明显抑制OX-LDL诱导损伤的RAW264.7细胞脂质吞噬能力。（ 2） 灯盏乙素能够明显下调OX-LDL诱导损伤的RAW264.7中PKC和TNF-α的蛋白和mRNA表达水平。 -
关键词:
- 灯盏乙素 /
- 巨噬细胞RAW264.7 /
- 氧化型低密度脂蛋白 /
- 蛋白激酶C /
- 肿瘤坏死因子-α
Abstract:Objectives To investigate the effects of scutellarin on lipid phagocytosis and the regulation of PKC, and TNF-α expressions in low density lipoprotein （OX-LDL） injured RAW264.7 cells. Methods Murine RAW264.7 macrophages was cultured in vitro. Then, the OX-LDL-induced injury model was replicated. Combined with oil red O staining, cellular cholesteryl ester content was also detected in OX-LDL-induced injury model. Furthermore, Western blot and RT-PCR methods were used to detect changes in PKC and TNF-α protein as well as mRNA expression in RAW264.7 cells. Results （1） The results of oil red O showed that the degree of cell red staining in model group was significantly higher than that in normal control group; compared with model group, the degree of cell red staining in simvastatin group, scutellarin 50 and 100 μmol/L group were lower than that in the model group; （2） The cholesteryl ester content assay showed that: compared with the normal control group, the CE/TC values of the model group cells were significantly increased at each time point; compared with model group, and cellular CE/TC values were significantly decreased in the dosing group at each time point. （3） WB and RT-PCR results showed that compared with normal control group, protein and mRNA expressions of PKC and TNF-α were increased in the model group; compared with the model group, protein and mRNA expression of PKC and TNF-α were decreased in simvastatin group, and scutellarin group showed a concentration-dependent downregulation of PKC and TNF-α expression. Conclusions （1） Scutellarin can significantly inhibit the levels of cholesterol in OX-LDL injuried RAW264.7 cells. （2） Scutellarin can down-regulated the protein and mRNA expressions of PKC, TNF-α in OX-LDL induced RAW264.7 cells. -
Key words:
- Scutellarin /
- RAW264.7 macrophages /
- oxidized low-density lipoprotein （OX-LDL） /
- PKC /
- TNF-α
-
室间隔穿孔（ventricular septum rupture，VSR）是ST段抬高型心肌梗死（ST-segment-elevation myocardial infarction，STEMI）严重机械并发症之一，发生率为0.2～0.5%[1]。VSR可导致严重的泵功能衰竭和心源性休克，一旦发生VSR患者的死亡率高达90%以上[2]。手术修复是VSR患者的最终治疗方案，在不同的手术时机施行室间隔修补术可以使患者的死亡率下降至19% ～ 60%[3]。关于STEMI患者施行VSR的手术时机，目前认为，由于在VSR刚发生的急性期内，VSR的边缘周围组织存在明显的组织水肿，同时在一定时期内VSR存在扩大的趋势；若早期实施手术干预，术中常常因为难以完全闭合缺损部位而导致手术不成功，因此，目前认为STEMI导致的VSR，若能够维持血流动力学稳定一月后再进行室间隔修补术可明显降低患者的死亡率[4−5]。如何在接受心脏外科手术前维持患者的血流动力学稳定，成为降低患者死亡率的关键。
主动脉内球囊反搏（intra-aortic balloon pump，IABP）是目前临床上最常用的治疗急性心肌梗死合并严重心力衰竭、心源性休克的心脏辅助装置，IABP可以增加冠状动脉血流灌注并减轻心力衰竭患者心脏的后负荷和减低心肌耗氧量并维持血压的稳定[6]，对于合并VSR的STEMI患者，需要置入IABP进行救治已经成为共识，但对于IABP的应用时机尚有异议。本研究选取35 例STEMI合并VSR患者，对其各项临床资料进行回顾性分析，通过对IABP 对于此类患者血流动力学及心功能改善作用的研究，探讨STEMI合并VSR患者IABP的应用时机。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
回顾分析昆明医科大学附属延安医院心内科 2019 年1月至 2023 年6月收治的35 例STEMI合并VSR患者的临床资料。纳入标准为：（1）根据2019 年我国急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南[7]，①持续30min以上典型的胸痛症状；②ST段在2个相邻心电图导联上抬高超过1 mm；③肌钙蛋白和心肌酶肌升高；（2）VSR的确诊标准：超声心动图检查发现室间隔回声连续性中断并有左向右分流。排除标准[8]：（1）合并恶性肿瘤患者；（2）精神疾病患者；（3）既往合并免疫系统疾病患者；（4）凝血功能异常及有使用低分子肝素禁忌的患者，IABP置入前血小板或血红蛋白低于正常低限的患者；（5）主动脉病变或创伤，如主动脉瘤、主动脉夹层和主动脉外伤等；（6）主动脉瓣严重关闭不全。患者及家属接受主动脉内球囊反搏置入的为IABP联合药物治疗组（n = 20），不接受主动脉内球囊反搏置入的为单纯药物治疗组（n = 15）。本研究通过昆明医科大学附属延安医院伦理委员会专家组审核通过[（2018）伦审Y第48号] 。所有研究对象签署伦理研究知情同意书。
1.2 治疗方法
所有35 例STEMI合并 VSR 患者均给予冠心病二级预防药物治疗，并根据患者的病情选择使用正性肌力制剂、利尿剂及血管活性药物。药物联合IABP组患者，使用Seldinger穿刺法经右股动脉穿刺置入动脉鞘管后置入IABP导管，以1∶1心电触发模式反搏。2 组患者的后续治疗计划均为限期转心脏外科进行室间隔修补术治疗。置入IABP后给予低分子肝素皮下注射抗凝治疗，间隔十二小时一次；同时保持术口清洁，定期复查血常规、凝血功能、肾功能，定期复查胸片以保障IABP导管处于合适的位置，定时观察术肢循环情况。
1.3 观察指标
观察所有入组患者的临床特点。对比药物联合IABP治疗组患者和单纯药物治疗组患者的平均动脉血压、中心静脉压力、平均心率、血乳酸水平、胸腔积液及肺部B线、BNP、左室射血分数（ left ventricular ejection fraction，LVEF） 的变化及住院期间的死亡率。观察药物联合IABP治疗组在IABP置入后，有无出血、血小板减少、下肢缺血、术口感染及肾脏缺血等IABP相关并发症。
1.4 统计学分析
统计学分析使用SPSS16.0统计软。计量资料采用均数±标准差（$ \bar x \pm s $）表示，组间比较采用独立样本t检验，治疗前后比较采用配对t检验；计数资料以百分数（%）表示。计数资料分析采用χ2 检验，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 患者临床基线特征
2组患者性别比例、年龄、VSR直径等临床基础情况差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性，见表1。
表 1 2组患者的临床资料［（$ \bar x \pm s $）/ n（%）］Table 1. Comparison of clinical data between two groups［（$ \bar x \pm s $）/ n（%）］组别 n 性别 年龄（岁） 高血压 糖尿病 室间隔穿孔直径（mm） 男 女 药物联合IABP组 20 8（40.0） 12（60.0） 68.8 ± 4.6 11（55.0） 8（40.0） 10.4 ± 5.3 单纯药物治疗组 15 7（46.7） 8（53.3） 65.4 ± 7.0 8（53.3） 7（46.7） 9.8 ± 4.9 χ2/t − 0.157 0.701 0.259 0.203 0.845 P − 0.671 0.490 0.611 0.650 0.392 2.2 2组患者泵功能和血液动力学改善的情况
药物联合IABP治疗组在治疗72 h后患者泵功能和血流动力学均有明显改善，表现为平均动脉压较治疗前升高，平均心率、BNP水平、乳酸水平、肌酐水平、胸腔积液例数及肺部B线较治疗前降低（P < 0.05）。而单纯药物治疗组在治疗72 h后平均动脉压、平均心率、BNP水平、乳酸水平、肌酐水平、胸腔积液及肺部B线与治疗前相比有恶化的趋势（P < 0.05）。治疗后，药物联合IABP治疗组患者的泵功能和血流动力学的改善情况明显优于单纯药物治疗组患者（P < 0.05）。详见表2、表3。
表 2 2组患者泵功能变化情况的比较［（$\bar x \pm s $）/ n（%）］Table 2. Comparison of cardiac function between the two groups ［（$\bar x \pm s $）/ n（%）］指标 时间 药物联合IABP组（n = 20） 单纯药物治疗组（n = 15） χ2/t P LVEF （$ \bar x \pm s$，%） 治疗前 34.6 ± 5.31 35.1 ± 3.34 1.33 0.18 治疗后 39.6 ± 6.10*# 31.6 ± 4.81 2.51 0.01*# BNP（pg/ml） 治疗前 4874.6 ± 325.344674.6 ± 416.51.26 0.21 治疗后 2684.6 ± 247.79*#5174.6 ± 525.63.94 <0.001*# 胸腔积液例（%） 治疗前 16（80） 11（73.33） 14.70 0.31 治疗后 7（35）*# 15（100） 29.51 0.012*# 肺部B线平均数（条） 治疗前 10.46 ± 2.10 11.6 ± 2.91 1.30 0.17 治疗后 4.5 ± 1.14*# 15.03 ± 2.81 3.01 0.002*# 注：与单纯药物治疗组治疗后比较， * P < 0.05；治疗后与治疗前比较，# P < 0.05 表 3 2组患者血液动力学的变化情况比较（$\bar x \pm s $）Table 3. Comparison of hemodynamic between the two groups （$\bar x \pm s $）指标 时间 药物联合IABP组（n = 20） 单纯药物治疗组（n = 15） t P 平均动脉压（mmHg） 治疗前 67.6 ± 5.3 64.1 ± 8.6 1.48 0.14 治疗后 75.6 ± 4.3*# 60.6 ± 7.3 2.91 0.021*# 心率（次/min） 治疗前 96.1 ± 12.7 99.6 ± 14.5 0.44 0.65 治疗后 84.2 ± 15.7*# 103.1 ± 9.6 3.21 0.013*# 中心静脉压（ cm H2O） 治疗前 15.6 ± 4.3 16.7 ± 3.7 1.56 0.12 治疗后 11.6 ± 2.8*# 17.7 ± 4.9 2.72 0.023*# 肌酐（μmol/L） 治疗前 127.6 ± 23.5 133.6 ± 25.1 0.47 0.59 治疗后 120.1 ± 16.3* 148.0 ± 26.2 2.36 0.025* 乳酸（mmol/L） 治疗前 2.85 ± 0.5 2.71. ± 0.6 1.35 0.18 治疗后 2.03 ± 0.5*# 3.60 ± 0.8 1.90 0.032*# 注：与单纯药物治疗组治疗后比较， *P < 0.05；治疗后与治疗前比较，#P < 0.05 2.3 2组患者的短期预后
20 例药物联合IABP治疗组患者，发生VSR 4周后有12例（ 60.0%） 存活：其中10 例于4周后转到心脏外科行冠状动脉搭桥手术联合VSR修补术，2 例患者4 周后患者不同意外科手术要求出院；8 例发生死亡，其中2 例在发生VSR 1 周内死亡，6 例在发生VSR 1 周后死亡；存活的12 例患者均于发生VSR 72 h内接受了IABP置入， 8 例死亡患者有6 例置入IABP的时机为发生VSR 72 h后。15例单纯药物治疗的患者中2 例（13.3%） 存活到4周后，13 例发生死亡，2 例在24 h内死亡，8 例在1 周内死亡，3 例在1 周后死亡。2 例存活患者VSR的直径均 < 5 mm。但LVEF下降的幅度明显高于药物联合IABP治疗组。2 组共计21例死亡患者，在血流动力学出现不稳定时，心脏外科均建议患者家属行急诊外科手术，1 例患者选择急诊外科手术，但于围术期死亡，见表4。
表 4 2组患者的短期预后比较[n（%）]Table 4. Comparison of short-term prognosis between the two groups [n（%）]组别 n 存活 死亡 药物联合IABP组 20 12（60.0） 8（40.0） 单纯药物治疗组 15 2（13.3） 13（86.7） χ2 − 7.78 P − 0.004 2.4 药物联合IABP治疗组的IABP相关并发症发生情况
药物联合IABP治疗组在IABP置入至因为完成外科手术、死亡或其他原因撤除IABP期间，无需要治疗的出血或血小板减少，亦无下肢缺血、感染、肾脏缺血等并发症；2 例患者出现IABP术口渗血，但均未导致血红蛋白明显下降；3 例患者血小板较置入前下降10%～30%，但血小板计数均高于50×109 /L而未行针对性治疗。
3. 讨论
3.1 影响STEMI合并VSR患者预后的因素
尽管STEMI患者VSR的发生率仅为1%～2%，但该类患者单纯药物治疗的死亡率超过90%[9]。目前认为经皮VSR介入封堵手术和外科VSR修补手术是挽救STEMI合并VSR患者生命降低死亡率的最有效治疗方法[10−12]。在STEMI早期，梗死周围心肌组织水肿、脆弱、易碎，修补缝合困难，手术易出现心脏破裂及急性泵功能衰竭，死亡率较高[13−14]。大量研究认为外科手术能推迟到STEMI发生后4周、心肌水肿消失、纤维化形成再行手术的成功率较高[4−5]。STEMI患者出现VSR时，由于血液快速从左心室向右心室分流造成肺循环血量增加、左心室前负荷加重，导致严重的泵功能衰竭，患者常常因泵功能衰竭继发的多器官功能损伤而无法进行手术治疗[15]，所以在围手术期维持泵功能及血流动力学的稳定是改善STEMI合并VSR患者预后的关键。
3.2 IABP对STEMI合并VSR患者治疗作用的分析
IABP是目前普及度最高的循环辅助装置，其工作原理是在心室舒张期充气，使舒张压升高从而增加外周组织器官的灌注和冠状动脉血流灌注，在心室收缩期放气从而降低左心室的后负荷，减少心肌耗氧量，稳定患者的血流动力学[16]。IABP广泛应用于各种原因引起的心脏功能衰竭、药物治疗无效的急性冠脉综合征、急性心肌梗死合并心源性休克、血流动力学不稳定的患者在行经皮冠状动脉介入治疗时的保护和支持[17-18]。对于合并VSR的STEMI患者，需要置入IABP进行救治已经成为共识，但对于IABP的应用时机仍存有争议。
本研究提示置入IABP 72 h后，观察药物联合IABP组的LVEF、血清BNP、平均有创动脉血压及中心静脉压等指标较置入前明显改善，观察指标明显优于单纯药物治疗组，提示置入IABP能使患者的泵功能得到显著改善。治疗72 h后，药物联合IABP治疗组的肌酐和乳酸水平较置入前无加重恶化，而单纯药物治疗组患者的肌酐和乳酸水平较治疗前明显升高，提示置入IABP能够有效维持组织灌注，而单纯药物治疗难以有效维持组织灌注。4 周后药物联合IABP治疗组有12例（60.0%）存活，单纯药物治疗组仅2（13.3%）例存活，且这2 例患者VSR小于5 mm；提示置入IABP能够通过对循环和组织灌注的改善而影响患者的预后，2 例单纯药物治疗组患者存活的原因考虑是因为较小的VSR对血液动力学的影响较小。在所有的死亡患者中，药物联合IABP组仅2 例（10%）在1周内死亡，而单纯药物治疗组有9 例（60%）在1 周内死亡，提示置入IABP能够明显减缓患者病情恶化的进程。药物联合IABP组死亡的8 例患者中，有6 例置入IABP的时机为发生VSR72h后，2 例为72 h内，提示IABP在VSR发生后越早置入患者获益越大。本研究通过对IABP相关并发症发生情况的观察，提示置入IABP后通过规范管理，长时间应用IABP相关并发症无增加的趋势。
3.3 本研究的创新性与局限性
综上所述，STEMI患者发生VSR后应该在药物治疗的同时应尽早置入 IABP，以迅速改善患者的泵功能、维持循环稳定，增加器官组织的灌注，为行外科手术且最终降低患者的死亡率争取时间；另外，长时间应用IABP相关并发症无增加的趋势。但由于本研究病例数较少，缺少长期观察随访结果，期待在后续研究中进一步明确药物联合尽早置入IABP治疗能否成为STEMI患者发生VSR 后施行外科修补手术前的首选治疗措施。
-
图 2 OX-LDL诱导损伤RAW264.7细胞的油红O染色（400×）
Figure 2. Oil red O staining of OX-LDL injured RAW264.7 cells （400×）
图 3 灯盏乙素对OX-LDL诱导损伤的RAW264.7内脂质的影响[（
$\bar x \pm s$ ），n = 6]Figure 3. Effects of Scutellarin on OX-LDL injured RAW264.7 cells lipid levels [（
$\bar x \pm s$ ），n = 6]
图 4 灯盏乙素对OX-LDL损伤的RAW264.7中PKC和TNF-α蛋白表达的影响[（
$ \bar x \pm s $ ），n = 6]注：a：PKC和TNF-α的蛋白表达电泳图；b,c：细胞损伤模型中PKC和TNF-α蛋白表达变化。用ImageJ 1.4.3.67对蛋白条带进行统计分析，βactin是内参。与空白对照组相比较，#P < 0.05；与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 4. Effects of scutellarin on OX-LDL induced RAW264.7 cells PKC and TNF-α protein expression [（
$ \bar x \pm s $ ），n = 6]
图 5 灯盏乙素对OX-LDL诱导的RAW264.7中PKC和TNF-α的mRNA表达的影响[（
$ \bar x \pm s $ ），n = 6]注：a，b：细胞损伤模型中PKC和TNF-α的 mRNA表达变化。与空白对照组相比较，#P < 0.05；与模型组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
Figure 5. Effects of Scutellarin on OX-LDL induced RAW264.7 cells PKC and TNF-α mRNA expression [（
$ \bar x \pm s $ ），n = 6]表 1 引物序列
Table 1. Primer sequence
基因名称 双向引物序列 β-actin Forward：5′ TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC 3′ Reverse：5′ GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC 3′ PKC Forward：5′ TCACCAAGGAATCCAAGGAC3′ Reverse：5′ CCAGGAGGGACCAGTTGATA3′ TNF-α Forward：5′ ACGGCATAAATCTCAAAGAC 3′ Reverse：5′ GTGGGTGAGGAGCACGTAGT 3′ 
下载: 导出CSV
-
[1] Jonas D E,Reddy S,Middleton J C,et al. Screening for cardiovascular disease risk with resting or exercise electrocardiography:evidence report and systematic review for the US Preventive Services Task Force[J]. JAMA,2018,319(22):2315-2328. doi: 10.1001/jama.2018.6897 [2] Ira Tabas,Karin E Bornfeldt. Macrophage phenotype and function in different Stages of atherosclerosis[J]. Circulation Research,2016,118(4):653-667. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.115.306256 [3] Silverstein R L. Linking metabolic dysfunction to atherosclerosis via activation of macrophage CD36 gene transcription by retinol binding protein-4[J]. Circulation,2017,135(14):1355-1356. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.117.027505 [4] Kasahara K,Tanoue T,Yamashita T,et al. Commensal bacteria at the crossroad between cholesterol homeostasis and chronic inflammation in atherosclerosis[J]. Journal of Lipid Research,2017,58(3):519-528. doi: 10.1194/jlr.M072165 [5] Fan H C,Fernandez-Hernando C,Lai J H. Protein kinase C isoforms in atherosclerosis:Pro or anti-inflammatory[J]. Biochemical Pharmacology,2014,88(2):139-149. doi: 10.1016/j.bcp.2014.01.006 [6] Lien C F,Chen S J,Tsai M C,Lin C S. Potential Role of Protein Kinase C in the Pathophysiology of Diabetes-Associated Atherosclerosis[J]. Frontiers in Pharmacology,2021,12:716332. doi: 10.3389/fphar.2021.716332 [7] Oberoi R,Vlacil AK,Schuett J,Schösser F,Schuett H,Tietge UJF,Schieffer B,Grote K. Anti-tumor necrosis factor-α therapy increases plaque burden in a mouse model of experimental atherosclerosis[J]. Atherosclerosis,2018,277:80-89. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2018.08.030 [8] M F Linton,J J Moslehi,V R Babaev,et al. Akt signaling in macrophage polarization,survival,and atherosclerosis[J]. International Journal of Molecular Sciences,2019,20(11):2703. [9] 张安邦,高杰,李令根,李义. 相关炎症因子与动脉粥样硬化的关系[J]. 中国中西医结合外科杂志,2014,10(5):563-566. doi: 10.3969/j.issn.1007-6948.2014.05.042 [10] 张卫东,陈万生,王永红,等. 灯盏花黄酮苷化学成分的研究[J]. 中草药,2000,31(8):565-566. doi: 10.3321/j.issn:0253-2670.2000.08.002 [11] 张小超,沈志强,杨仁华,等. 灯盏乙素对大鼠动脉粥样硬化的防治作用[J]. 中药药理与临床,2017(2):59-63. [12] 曹慧敏,宋囡,张妮,等. 丹参酮ⅡA通过P13K/Akt/mTOR信号通路调控自噬抗内皮细胞氧化应激损伤研究[J]. 北京中医药大学学报,2017,40(11):933-940. doi: 10.3969/j.issn.1006-2157.2017.11.011 [13] Malekmohammad K,Bezsonov E E,Rafieian-Kopaei M. Role of lipid accumulation and inflammation in atherosclerosis:Focus on molecular and cellular mechanisms[J]. Frontiers in Cardiovascular Medicine,2021,8:707529. doi: 10.3389/fcvm.2021.707529 [14] Xu H,Jiang J,Chen W,Li W,Chen Z. Vascular Macrophages in Atherosclerosis[J]. Journal of Immunology Research,2019,2019:4354786. [15] Hussain S,Assender J W,Bond M,et al. Activation of protein kinase C zeta is essential for cytokine induced metallo-proteinase-1,-3,and -9 secretion from rabbit smooth muscle cells and inhibits proliferation[J]. Journal of Biological Chemistry,2002,277(30):27345-27352. doi: 10.1074/jbc.M111890200 [16] Chih-Tung Chiu,Sheng-Nan Kuo,Shao-Wen Hung,et al. Combined treatment with hyaluronic acid and mesalamine protects rats from inflammatory bowel disease induced by intracolonic administration of trinitrobenzenesulfonic acid[J]. Molecules,2017,22(6):904-912. doi: 10.3390/molecules22060904 [17] Hong Jin,Daniel Y. Li,Ekaterina,et al. Local Delivery of miR-21 Stabilizes Fibrous Caps in Vulnerable Atherosclerotic Lesions.[J]. Molecular Therapy,2018,26(4):1040-1055. doi: 10.1016/j.ymthe.2018.01.011 -
下载:
点击查看大图
计量
- 文章访问数: 3450
- HTML全文浏览量: 2010
- PDF下载量: 111
- 被引次数: 0
