Establishment of Spinal Cord Ischemia Injury Model in Rats by Thoracic Aorta Occlusion Combined with Aortic Bypass
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摘要:
目的 改良大鼠脊髓缺血损伤动物模型。 方法 大鼠分为3组:实验组,阻断胸主动脉(T4-T11)+主动脉旁路循环(胸主动脉起始部-胸主动脉近膈肌部),阻断20 min;对照组,阻断胸主动脉(T4)20 min;假手术组,只开胸不阻断胸主动脉。术中采用经颅运动诱发电位(Tc-MEP)监测脊髓功能,术后7 d观察脊髓切片病理改变;采用BBB评分评估脊髓功能,28 d分析大鼠生存曲线。 结果 实验组Tc-MEP波形6 min后消失,对照组8 min后Tc-MEP波形消失,直至手术结束。脊髓切片显示实验组神经元大量变性坏死,对照组多个神经元坏死。实验组比对照组BBB评分下降明显;28 d生存率差异有统计学意义(P < 0.05)。 结论 胸主动脉阻断+主动脉旁路循环方法,对比传统的胸主动脉阻断方法,效果确切,存活率高。 Abstract:Objective To modify the rat model of spinal cord ischemia injury. Methods The rats were divided into three groups. In experimental group, thoracic aorta was cross-clamped between T4 and T11, and aortic bypass circulation was established from proximal thoracic aorta to proximal diaphragmatic aorta. The interval of clamping was 20 minutes. In control group, the thoracic aorta (T4) was cross-clamped for 20 minutes.In the sham operation group, only thoracotomy was performed without thoracic aorta cross-clamping. Thefunction of spinal cord was monitored by transcranial motor evoked potential (TC-MEP). The pathology of spinal cord were observed 7 days after surgery. The locomotor function of spinal cord was evaluated by BBB score at multiple postoperative time. The survival curves were analyzed 28 days after operation. Results The TC-MEP waveform of the experimental group disappeared after 6 minutes, and that of the control group disappeared after 8 minutes until the end of surgery. The slices of spinal cord showed a large number of degeneration and necrosis of neurons in the experimental group. Multiple neurons were necrotic in the control group. The BBB score of the experimental group decreased more obviously than that of the control group. There was a significant difference in the 28-day survival rate between the experimental group and the control group, and (P < 0.05). Conclusion Thoracic aortic cross-clamping plus aortic bypass is an effective method, with high long-term survival rate. -
Key words:
- Spinal cord ischemia injury /
- Animal model /
- Aortic bypass /
- Aortic cross-clamping
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大鼠脊髓血管解剖结构与人类大致相似,手术感染相对少见,是最常用的SCII实验动物[1-7]。目前建立大鼠SCII模型的方法,分为阻断主动脉弓、胸主动脉以及腹主动脉,采用的阻断方法包括开放手术或介入技术[1-3, 8]。阻断主动脉弓或胸主动脉的方法,在阻断位置的远心端,脊髓缺血的同时,会引起腹腔脏器缺血,导致动物死亡[2, 8-9]。而选择阻断肾下腹主动脉,虽然避免了腹腔脏器缺血,但这种方式阻断的脊髓动脉范围小,不能造成充分的脊髓缺血损伤[10-12]。且这一方法与临床脊髓缺血损伤的机制是不同,与临床研究需要有偏差。
本研究探索一种模拟临床的长期存活的脊髓缺血损伤实验动物模型的制备方法,即胸主动脉阻断+旁路循环方法,建立大鼠长期存活的脊髓缺血损伤的动物模型,以传统开胸阻断胸主动脉方法作为对照,效果较好,现报道如下。
1. 材料与方法
1.1 实验动物及分组
本研究经昆明医科大学动物实验伦理委员会审核并批准 [(2017)伦审L第36号],遵循3R原则。60只SD健康雄性大鼠,体重450~500 g,13周龄,SPF 级,购自昆明医科大学实验动物中心[ SCXK(滇)K2020-0004]。实验前在昆明医科大学实验动物中心[SYXK(滇)K2020-0006]饲养1周,均标准饲料喂养,自由饮水,湿度为 50% ~ 60%,室温为(24±1)℃,昼夜循环12 h,光线和通风情况良好。
随机分为3组(实验组20只、对照组20只、假手术组20只)。实验一:15只(每组5只),术中采用经颅运动诱发电位(Tc-MEP)监测脊髓功能,术后7 d处死进行组织化学检测。实验二:45只(每组15只),术后不同时间点采用BBB评分评估脊髓功能,28 d进行生存分析。
1.2 实验方法
1.2.1 动物麻醉
异氟醚诱导麻醉。左颈外静脉置入静脉导管(PE-10)持续输注氯胺酮25 mg/(kg·h)。气管插管,机械通气,平稳后停用异氟醚。手术结束后,停止输注氯胺酮。自主呼吸恢复后,拔除气管插管。
1.2.2 手术方法
所有大鼠使用可弯曲探头监测直肠温度。大鼠身下铺保温垫,备红外线加热灯,用保温垫、红外线加热灯维持体温在(37.5±0.5)℃。
实验组--阻断胸主动脉(T4~T11)+主动脉旁路循环(胸主动脉起始部-胸主动脉近膈肌部)。
大鼠左胸后外侧切口,第4肋间显露,分离锁骨下动脉开口处降主动脉,以7-0 Prolene线缝置近端荷包,紧贴荷包远心端套丝线,作为近端阻断部位(T4)。第8肋间显露,在膈肌上方主动脉处缝置远端荷包,紧贴其近心端套阻丝线,作为远端阻断部位(T11)。用18GA套管针从近端荷包处穿刺置管,推入肝素3 mg/kg。远端荷包处同样方法穿刺置管。然后用一个三通开关连接近、远端管道,形成胸主动脉的旁路循环。近端、远端分别用无创动脉夹阻断胸主动脉(图1)。阻断20 min,然后开放无创动脉夹,恢复主动脉血流。鱼精蛋白中和肝素(比例1∶1)。根据需要通过三通开关适当补液。拔出套管针,荷包线打结。止血、关胸,手术切口涂抹红霉素软膏。术后回笼,单独饲养。肌注青霉素20万U,每天2次,连续7 d。尿潴留的大鼠,人工辅助排尿,排便,每天3次。注意预防感染、压疮和自噬现象。
对照组--阻断胸主动脉(T4):开胸方法同实验组,无创动脉夹阻断T4水平胸主动脉,20 min后,开放动脉夹。随后处理同实验组。假手术组--只开胸不阻断胸主动脉。
开胸方法同实验组,不阻断胸主动脉。
1.2.3 Tc-MEP(transcranial
motor evoked potentials,Tc-MEP) 监测 选用针状电极,刺激电极置于头部C1、C2点,记录电极分别放在上肢近端肌群、后肢腓肠肌群。使用Cadwell32通道术中监护系统(Cascade,美国Cadwell公司)。开胸手术前获得基线,主动脉阻断后每隔1分钟监测1次,波形消失后每隔2分钟监测1次,至手术结束。判断Tc-MEP异常以全或无为标准,电位消失表示脊髓功能缺失[4]。
1.2.4 脊髓组织化学分析
术后7 d,处死实验一的15只大鼠,制作脊髓切片,取缺血中心区最严重的T8水平脊髓,苏木素-伊红(HE)染色,镜下观察。
1.2.5 脊髓运动功能评估
采用BBB 评分(Basso,Beattie & Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale) 作为大鼠脊髓神经功能评价标准[5-6]。术前0 d及术后1,3,5,7,14,28 d分别对实验二大鼠进行评分。最高21分,最低0分,双后肢得分的平均值作为每个大鼠BBB评分的最终得分。
1.2.6 生存分析
观察实验二大鼠到术后28 d,记录各组大鼠的存活情况。
1.3 统计学处理
使用统计软件GraphPadPrism 7.00进行统计分析及作图。BBB评分分析采用t检验,生存分析采用Kaplan-Meier法,Log-rank检验进行2组间的生存率比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 Tc-MEP结果
麻醉稳定后,监测到的Tc-MEP波形为双相波,作为基线。上肢Tc-MEP作为参照,下肢Tc-MEP在胸主动脉阻断后波形消失;但消失的时间点不同,实验组平均6 min,对照组平均8 min。在主动脉恢复血流后,直至手术结束,Tc-MEP波形均未恢复,表明因脊髓缺血造成脊髓运动功能受损。假手术组Tc-MEP波形无变化(图2)。
2.2 BBB评分
实验组、对照组BBB评分术后均下降,实验组明显低于对照组,差异有统计学意义(P < 0.05);随术后时间延长,2组BBB评分均有恢复,相同的时间点实验组均低于对照组,差异有统计学意义(P < 0.001),见图3。假手术组BBB评分无降低。
2.3 脊髓HE染色
实验组大量神经元变性坏死,可见炎症细胞浸润。对照组神经元变性,多个神经元细胞坏死,可见炎症细胞浸润,未见凋亡细胞。假手术组脊髓组织结构完整,神经元形态正常,见图4。
2.4 生存分析
术后28 d为实验终点,实验组生存率为73.3%,对照组40.0%,差异有统计学意义(P = 0.0412),见图5。死亡大鼠尸检结果显示,实验组死亡原因为失血过多、感染。对照组死亡原因为肾脏、肠道缺血梗死、失血过多、肺部感染、膀胱感染,死亡时间集中在术后3 d。假手术组死亡原因为失血过多、肺部感染。
3. 讨论
本实验方法是针对大鼠胸主动脉阻断建立脊髓缺血损伤模型的改进。在保证阻断脊髓大部分血供的同时,通过建立阻断节段的近、远端旁路循环,提供阻断期间远端脏器供血,避免主动脉阻断带来的远端缺血副损伤。本实验术中TcMEP监测证实脊髓在阻断胸主动脉后出现功能异常,术后BBB评分、脊髓病理均证实脊髓损伤模型的建立。实验组死亡的大鼠尸检没有发现腹腔脏器缺血的表现。
大鼠脊髓缺血损伤模型,多采用开胸法,或介入球囊,阻断胸主动脉而建立。这两种方法,在造成脊髓缺血损伤的同时,也会造成腹腔脏器缺血,引起肾脏、肠道缺血梗死,导致动物死亡[8-9]。M Marsala[9]详细描述了这一后果:直肠温在36.5~37.0 ℃,主动脉阻断20 min,6只中有4只大鼠发生截瘫;主动脉阻断30 min,6只中有3只大鼠在术后3~4小时死亡,尸检显示肾和肠道梗死。本实验大鼠直肠温在37~38 ℃,实验组采用胸主动脉阻断+主动脉旁路循环方法,与对照组采用的传统胸主动脉夹闭方法对比,脊髓缺血损模型成功率高(P < 0.05),没有腹腔脏器缺血并发症,28 d生存率高于胸主动脉夹闭方法(P < 0.05)。
本实验的开胸阻断+旁路循环方法与传统的阻断主动脉相比,有以下特点:(1)阻断强度,本实验是完全阻断主动脉,从该段发出的脊髓供血被完全阻断;传统方法阻断的远心端主动脉,因侧枝循环仍有部分血供,该区域的脊髓供血并未完全中断;(2)对其它脏器的影响,本实验的旁路循环供应阻断期间的阻断部位远端主动脉血供,对阻断部位远心端的脏器没有影响;传统方法阻断主动脉后会引起远心端脏器缺血。本实验优势:(1)效果更确切,阻断主动脉引起的缺血副损伤更小,克服了以前缺血模型中下肢、腹(盆)腔脏器直接缺血损伤对脊髓缺血损伤的影响;(2)通过旁路循环管道可以补液、用药、进行体温调节,为药物干预、低温保护等研究提供更便捷的造模方法。缺点是操作比较复杂,精细度要求高,需要良好的动物实验操作技术。
“胸主动脉阻断+主动脉旁路循环”的方法制备长期存活的大鼠脊髓缺血损伤模型,实验结果显示该模型制备效果确切,长期存活率高,可作为、SCII模型的一个选择。
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