Application of Different Sealing Materials and Adhedive Systems in Pit and Fissure Sealing of Deciduous Molars
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摘要:
目的 比较树脂型窝沟封闭剂与树脂加强型玻璃离子结合不同粘接系统应用于乳磨牙窝沟封闭的操作时长、接受度及封闭效果，为口腔医疗资源匮乏地区的儿童提供更适宜的口腔医疗保健措施。 方法 将符合条件的第2乳磨牙随机分为3组：树脂型窝沟封闭剂 + 全酸蚀组（SO组，对照组），树脂型窝沟封闭剂 + 自酸蚀粘结剂组（SE组），树脂加强型玻璃离子 + 自酸蚀粘结剂组（SS组）。进行窝沟封闭并记录操作时间与治疗感受度，3、6、12个月复查封闭剂保存情况及患龋情况。 结果 （1） SO组62人共纳入228颗牙，SS组63人共纳入234颗，VS组56人共纳入221颗牙；（2）SE组操作时间（181.88±12.37）s及SS组（103.07±11.37）s与对照组SO组操作时间（108.56±8.65）s，差异具有统计学意义（Z = 460.163，P < 0.001）；（3）与另外2组相比，SO组的治疗感受度较差（ Z = 20.232，P < 0.001）；（4）3 m复查时，SO组封闭剂保存率和龋发病率分别为100%、0%，SS组保存率和龋发病率为62.1%、2.2%，VS组保存率和龋发病率为93.1%、1.8%；6 m复查时，SO组封闭剂保存率和龋发病率分别为98.2%、1.8%，SS组保存率和龋发病率为52.3%、4.2%，VS组保存率和龋发病率为89.2%、3.3%；12 m复查时，SO组封闭剂保存率和龋发病率分别为95.0%、5.0%，SS组保存率和龋发病率为42.8%、7.2%，VS组保存率和龋发病率为78.9%、6.2%。3次复查中，SO组的保存率最高，3组封闭剂保存差异均具有统计学意义（3 m复查 χ2 = 144.286，P < 0.001；6 m复查 χ2 = 159.703，P < 0.001；12 m复查 χ2 = 152.945，P < 0.001）但3组的防龋效果相似（3 m复查 χ2 = 4.842，P = 0.089；6 m复查χ2 = 2.153，P = 0.341；12 m复查χ2 = 0.915，P = 0.613）。 结论 自酸蚀粘接剂结合树脂加强型玻璃离子可简化操作步骤、提高患儿的舒适度且封闭效果较好，对口腔医疗资源匮乏地区封闭技术的推广来说是一种切实有效的选择。 Abstract:Objective To compare the operation time, acceptability and sealing effect of resin-based sealant and resin-reinforced glass ionomer combined with certain adhesive systems applied to seal deciduous molar teeth, so as to provide a more appropriate oral health promotion activity for children in areas with insufficient oral medical resources. Methods The qualified second deciduous molars were randomly divided into three groups: ClinproTM Sealant + phosphoric acid etching （the control group）, ClinproTM Sealant + Single bond Universal, ClinproTM XT Vanish + Single bond Universal.The pit and fissure sealant were applied, operation time and treatment sensitivity were recorded. After 3, 6, and 12 months, preservation conditions and caries incidence were reviewed. Results （1）A total of 62 people in SO group included 228 teeth, 63 people in SS group included 234 teeth, and 56 people in VS group included 221 teeth. （2）The operating time of SE group （181.88±12.37） s and SS group （103.07±11.37） s was significantly different from that of SO group （108.56±8.65） in control group （Z = 460.163, P < 0.001）. （3） Compared with the other two groups, the treatment sensitivity of SO group was worse （Z = 20.232, P < 0.001）. （4） At reexamination 3 months after operation, the preservation rate of sealant and the incidence rate of caries were 100% and 0% in SO group, 62.1% and 2.2% in SS group, and 93.1% and 1.8% in VS group, respectively; At reexamination 6 months after operation, the preservation rate of sealant and incidence rate of caries in SO group were 98.2% and 1.8% respectively, the preservation rate and incidence rate of caries in SS group were 52.3% and 4.2%, and the preservation rate and incidence rate of caries in VS group were 89.2% and 3.3% respectively; At reexamination 12 months after operation, the preservation rate of sealant and the incidence rate of caries in SO group were 95.0% and 5.0% respectively; the preservation rate and the incidence rate of caries in SS group were 42.8% and 7.2%, and the preservation rate and the incidence rate of caries in VS group were 78.9% and 6.2%. Among the three reexaminations, the preservation rate of SO group was the highest, and the difference in the preservation of sealants among the three groups was statistically significant （ χ2 = 144.286, P < 0.001; χ2 = 159.703, P = < 0.001; χ2 = 152.945, P < 0.001）, but the caries prevention effect of the three groups was similar （ χ2 = 24.842, P = 0.089;χ2 = 2.153, P = 0.341; χ2 = 0.915, P = 0.613） Conclusion The self-etching adhesive combined with resin-reinforced glass ionomer can simplify the operation procedure, improve the comfort of children, and achieve good sealing effect, which is a practical and effective choice for the promotion of sealing technology in economically underdeveloped areas. -
肝内胆管癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤[1]，预后差，近年来，其发病率逐年升高[2]。腺苷酸激酶4（Adenylate kinase4，AK4）是腺苷酸激酶家族的一员，其分子量为25kDa，别称为AK3L1。多项研究显示AK4促进恶性肿瘤的发生发展[3-5]。但其对肝内胆管癌的作用尚无报道。本实验通过小干扰RNA手段，就AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移能力的影响作出探究。
1. 资料与方法
1.1 细胞系
本实验所用肝内胆管癌细胞HUCCT1购自上海誉驰生物科技有限公司，该细胞已通过中国科学院昆明动物研究所鉴定明确。该细胞作为肝内胆管癌细胞株之一，常用于肿瘤增殖、迁移的研究。
1.2 小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）转染细胞
本实验采用siRNA技术以沉默AK4。siRNA购自上海市吉玛基因生物技术有限公司，共计构建6条si-RNA序列，序列设计见表1。本次实验分组为空白对照组（CON）、阴性对照组（siRNA-NC）、阳性对照组（siRNA-GAPDH）、实验组1（siRNA-AK4-1），实验组2（siRNA-AK4-2），实验组3（siRNA-AK4-3）。转染试剂采用上海市吉玛基因生物技术有限公司GP-transfect-Mate。采用免疫印迹法（Western Blot，WB）对实验组1、实验组 实验组3进行si-RNA筛选，其中空白对照组不添加siRNA，阴性对照组基因序列与目的基因序列无同源性，阳性对照组基因序列与内参GAPDH同源。各组间其余实验操作步骤（转染方法、WB、EdU、细胞划痕实验）均一致。
表 1 si-RNA序列Table 1. Sequence of si-RNA built by siRNA technology组别 序列 Antisense Negative control 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ GAPDH Positive control 5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′ 5′-AACCAUGUAGUUGAGGUCATT-3′ siRNA-AK4-1 5′-GCGGAAGGGUAUAUAACCUTT-3′ 5′-AGGUUAUAUACCCUUCCGCCT-3′ siRNA-AK4-2 5′-CAGGCUAAGACAGUACAAATT-3′ 5′-UUUGUACUGUCUUAGCCUGTT-3′ siRNA-AK4-3 5′-CACCUAUUCAGUCCAAAGATT-3′ 5′-UCUUUGGACUGAAUAGGUGTT-3′ 转染前1 d将HUCCT1细胞接种至6孔板中，以次日细胞融合度达到60%～80%为宜，用无抗生素的完全培养基进行培养。转染：（1）转染试剂室温备用；（2）按照每孔200 µL无血清培养基（1640培养基）加5～8 µL转染试剂配置转染试剂混合物。静置5 min；（3）按照每孔200 µL无血清培养基（1640培养基）加150/pmol siRNA配置siRNA混合物。静置5 min；（4）将转染试剂混合物滴加到siRNA混合物中，混匀，静置20 min；（5）20 min后将混合液均匀加至6孔板各孔中；（6）各孔另外加入1 600 µL无抗生素完全培养基；（7）孔板放入细胞培养箱中培养48 h，使用免疫印迹检测转染效率。
1.3 免疫印迹实验检测转染效率及siRNA筛选
（1）裂解细胞：使用PMSF（品牌：Beyotime，货号：ST506-2 PMSF）与RIPA裂解液（强）品牌：Beyotime，货号：P0013B）按照200∶1配置细胞裂解液。于冰上充分裂解细胞；（2）测蛋白浓度：取裂解产物于4 ℃离心机12000 r/min，离心30 min。吸取86 µL上清液，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（品牌：Beyotime，货号：P0012 500次）测定蛋白浓度；（3）取80 µL上清液加20 µL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（品牌：Beyotime，货号：P0015L）沸水加热15 min；（4）电泳：配置12%下层胶，5%上层胶，蛋白上样量为2.5 µg，上层胶60 V恒压电泳，下层胶100 V恒压电泳；（5）转膜：甲醇浸泡PVDF膜，胶、膜放置妥当后以300 mA恒流条件下湿转发转膜，时间为30 min；（6）封闭：PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭，缓慢摇晃，室温封闭2 h；（7）：孵育一抗：兔单克隆抗体[EPR7678] to AK3L1抗体，（1∶7000，品牌：Abcam，货号：ab131327）。一抗孵育过夜，4 ℃；（8）：孵育二抗：山羊抗兔IgG（H+L）（品牌：Proteintech，货号：SA00001-2，1∶10000），室温孵育2 h；（9）显影：ECL化学发光液孵育1 min后，于成像仪中曝光显影。
1.4 增殖EdU实验
（1）转染细胞：6孔板培养细胞。免疫印迹实验已明确siRNA-AK4-3的沉默效果最好，故本次实验使用siRNA-NC及siRNA-AK4-3做细胞转染。分组亦同。转染完成24 h开始进行EdU实验。（2）工作液孵育：使用BeyoclickTM Edu-555配置2XEdU工作液后（品牌：Beyotime，货号：C0075s），与无抗生素完全培养基等体积加入六孔板中，孵育2 h。（3）：固定、染色：每孔1 mL固定液固定15 min，洗涤后加入通透液孵育15 min，Click反应液孵育15 min，1X Hoechst 33342溶液孵育10 min。（4）：荧光检测：洗涤液清洗后于倒置荧光显微镜观察。
1.5 细胞划痕实验
（1）转染细胞：6孔板培养细胞。本次实验分组为siRNA-NC及siRNA-AK4-3。转染完成24 h开始细胞划痕实验。（2）画线：使用直尺于6孔板背面作横行画线。（3）划痕：待细胞融合度为95%～100%时，使用200 µL枪头沿直尺作垂直于画线的划痕。（4）冲洗：使用PBS冲洗孔板3次，动作轻柔，吸净PBS后，加入无血清1640培养液。（5）拍照：每孔以“十”字交叉处上下为定点，于0 h，12 h，24 h，36 h拍照，对比不同时间下各组细胞迁移能力，并进行统计分析。
1.6 统计学处理
数据分析使用GraphPad Prism 8及SPSS 26统计软件，计量资料采用（
$\bar x \pm s $ ），计数资料用t检验，3组及多组计量资料采用单因素方差分析。所有检验取两端。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 siRNA转染效率及筛选
免疫印迹法检测各组后量化结果分别为：空白对照组（CON）：（0.9±0.01，）阴性对照组（siRNA-NC）：（0.92±0.01），阳性对照组（siRNA-GAPDH）：（0.95±0.04），实验组1（siRNA-AK4-1）：（0.74±0.08），实验组2（siRNA-AK4-2）：（0.45±0.04），实验组3（siRNA-AK4-3）：（0.24±0.02）。免疫印迹结果显示各组内参齐，沉默效果较好，其中阳性对照组对GAPDH的沉默效果显著。各siRNA组中siRNA-AK4-3对AK4的沉默效果最好，见图1，2。因此，后期实验使用siRNA-NC作为对照组，siRNA-AK4-3作为实验组。
图 2 各组细胞中AK4蛋白的相对表达量siRNA-GAPDH组为阳性对照，取GAPDH/AK4。各组分别与siRNA-NC组比较，除CON组无统计学差异其余各组均有统计学差异。**P < 0.01，***P < 0.005，****P < 0.001。Figure 2. The relative expression level of AK4 protein in each group2.2 增殖EdU实验
Edu实验结果显示：siRNA-NC组增殖细胞（15.9±4.4）/视野，细胞总数（110.9±22.4）/视野。siRNA-AK4-3组增殖细胞数目（12.8±5.0）/视野，细胞总数（116.7±22.1）/视野。两组增殖比率有差异，差异有统计学意义。siRNA-NC组增殖细胞多于siRNA-AK4-3组，AK4促进细胞增殖，见图3，4。
图 3 EdU检测siRNA-NC与siRNA-AK4-3细胞的增殖情况（×200）Figure 3. The proliferation of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells was detected by EdU （×200）
图 4 siRNA-NC组与siRNA-AK4-3的细胞增殖比率*P < 0.05。Figure 4. The proliferation rate of siRNA-NC group and siRNA-AK4-3图3中EdU中增殖的HUCCT1细胞被标记为红色荧光，Hoechst 33342中蓝色荧光标记的为视野下所有活细胞，Merge图由EdU和Hoechst 33342图像合并后得到。
2.3 细胞划痕实验
划痕实验取划痕面积/视野总面积，各组面积比见表2，差异有统计学意义，见图5，6。siRNA-NC组细胞迁移面积较siRNA-AK4-3组更大，AK4促进细胞迁移。
表 2 划痕面积比Table 2. Scratch area ratio项目 0 h 12 h 24 h 36 h siRNA-NC 0.39 ± 0.01 0.26 ± 0.017 0.12 ± 0.017 0.08 ± 0.026 siRNA-AK4-3 0.39 ± 0.005 0.33 ± 0.001 0.24 ± 0.024 0.24 ± 0.027 
图 5 siRNA-NC与siRNA-AK4-3细胞划痕后面积变化，图中红色边缘为Image J软件勾勒Figure 5. The area changes of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells after scratches，and the red edge in the figure is outlined by Image J software
图 6 siRNA-NC组与siRNA-AK4-3组细胞划痕后面积占视野总面积比的变化*P < 0.05，**P < 0.01。Figure 6. In the siRNA-NC group and siRNA-AK4-3 group，ns represented no difference in the ratio of cell area to total field area after scratches3. 讨论
肝内胆管癌的手术治疗是极其重要的，目前全球范围内术后其平均无瘤生存时间（ DFS） 为12 ～ 36 个月[6-7]，但胆管癌起病隐匿，多数患者在发现疾病时已属晚期[8]，据报道，肝内胆管癌的根治切除率为30%～40% ，其他肝胆恶性肿瘤均比此数据高[1，9]。肝内胆管癌的辅助化疗（吉西他滨联合铂类）在一定程度上实现肿瘤将期，从而获得手术机会[10-12]，但其中位生存期仍然不到1 a时间[13-15]。根据Andrew X Zhu的RCT临床研究，靶向药物Ivosidenib使得患者有10.3个月的中位生存期，而安慰剂组仅有7.5个月[16]，Abou-Alfa GK等学者也通过RCT实验研究了Ivosidenib在胆管癌中的作用，其结果是实验组的无病生存期为2.7个月（95% CI：1.6～4.2），而安慰剂组的无病生存期为1.4个月（95% CI：1.4～1.6）[17]。A Demols也在胆管癌的靶向治疗上进行了RCT研究，他研究了靶向药Regorafenib对胆管癌作用，最终得出实验组无病生存期为3.0个月（95% CI：2.3～4.9），而对照组无病生存期为1.5个月（95% CI：1.2～2.0），然而实验组的总生存时间和对照组的总生存时间并无统计学差异[18]。可以看出，靶向药能提高患者生存时间，但有研究显示部分靶向药并不能显著提升患者的总生存率[18, 19]。因此需寻找一个更有效的作用靶点。
1944年，美国学者Kalckar在实验中首次发现了肌苷酸[20]。在随后的科学实践中，更名为腺苷酸激酶AK。AK4定位于细胞线粒体基质内，在肝脏、心脏、脑、肾脏、胃肠道组织中富于表达[21]，AK4在细胞能量代谢方面表现出特异性[22]，因此他与肿瘤应该存在相关性。2012年由台湾地区学者Yi-Hua Jan完成了首例AK4与癌症关系论证的研究：体外试验中shRNA沉默肺癌细胞CL1-5和A549中的AK4后，两株细胞的侵袭能力下降约50%，从而证实AK4促进肺癌细胞的侵袭[3]。连云港市的学者MinMin HUANG在研究中显示AK4在人浆液性卵巢癌组织中高表达。在体内试验中，AK4敲低组的肿瘤体积明显减小，肿瘤重量明显减轻。这些试验均显示AK4促进了人浆液性卵巢癌的发生发展[4]。Jie Zhang等在Her-2阳性乳腺癌中的研究显示AK4的表达水平与肿瘤TNM分期（P = 0∶017）和淋巴结转移（P = 0∶046） 显著相关。体外试验中，MTT法、细胞划痕实验和Transwell试验都显示敲低AK4组的癌细胞增值、迁移、侵袭能力减弱。体外试验也显示敲低了AK4的肿瘤组织体积减小，重量减轻[5]。此后AK4与肿瘤的研究未曾断绝，田华等学者通过免疫组化等方法证实了AK4在肺腺癌中高表达[23]。李辰运的研究显示AK4在胰腺导管腺癌中高表达，并且与肿瘤分期、淋巴结转移、神经受侵、脉管内瘤栓有相关性（P < 0.05）[24]。李绍军等也证实AK4在食管鳞状细胞中高表达[25]，夏林等也通过免疫组化的方式证实了AK4在胃癌中高表达[26]，尽管我国的多数学者都明确了AK4在大多数肿瘤中的表达，但是很遗憾，仅有少数人通过体内、体外实验论证AK4对相关癌症的影响，无法将他们的研究进一步转化为临床制定治疗方案的依据。
本实验首次论证AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移的影响。首先予siRNA沉默AK4的表达，再通过EdU检测细胞增殖能力，细胞划痕实验检测细胞迁移能力。本次实验的结论与前人的研究结论相似，即AK4促进肝内胆管癌细胞HUCCT1的增殖、迁移。本实验的不足在于，笔者尚未完成AK4对肝内胆管癌细胞其他生物学能力的影响，如EMT、侵袭等等。因此，笔者接下来即将完成其他细胞生物学行为实验，并且探究在机制方面的变化以及通过体内实验验证结论。本实验结论将为肝内胆管癌的临床分子靶向治疗提供基础实验数据，采用生物医学工程技术干预肝内胆管癌组织中AK4的表达，将有助于肿瘤的综合治疗。
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图 1 实验进展流程图（n为人数，N为牙数）
Figure 1. Flow chart of the study process（n- number of included participants，N- number of the study tooth）
图 2 不同封闭材料的封闭效果
A：ClinproTM Sealant封闭后（上颌）；B：ClinproTM Sealant复查（上颌）；C：ClinproTM Sealant封闭后（下颌）；D：ClinproTM Sealant复查（下颌）；E：ClinproTM XT Vanish封闭后（上颌）；F：ClinproTM XT Vanish复查（上颌）；G：ClinproTM XT Vanish封闭后（下颌）；H：ClinproTM XT Vanish复查（下颌）。
Figure 2. Effect of different pit and fissure sealing materials
表 1 儿童治疗感受度评分
Table 1. The score of children’s treatment feeling
评分 表情 表现 1 不紧张 能迅速、准确回答医生的问题，表情淡定自然。 2 有点紧张 愿意并能准确回答医生问题，但面部表情不自然，手脚不自然放置，不自觉举手、抬脚。 3 比较紧张 能够回答问题，但声调和语速受紧张影响而改变，身体不自然扭动，举手、
抬脚等动作增加，但比较受控，有时叫停，不影响医生的操作。4 恐惧 想要拒绝治疗，哭叫，手常抬起，想要阻止医生操作，需要强硬的语气命令才能配合，操作受到影响。 5 特别恐惧 持续哭闹，身体不停扭动，需要助手辅助控制身体才能继续治疗，治疗非常困难。 
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表 2 3组操作时间的比较
Table 2. Comparison of operation time among three groups
组别 牙数 操作时间（s） SO组 228 181.88 ± 12.37 SS组 234 103.07 ± 11.37△ VS组 221 108.56 ± 8.65△& Z 460.163 P < 0.001 * *P < 0.05；与SO组比较， △P < 0.05；与SS组比较， &P < 0.05。
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表 3 3组儿童治疗感受情况[n（%）]
Table 3. The children’s treatment feeling among three groups [n（%）]
组别 评分 合计 1 2 3 4 5 SO组 20（32.3） 10（16.1） 8（12.9） 15（24.2） 9（14.5） 62（100.0） SS组 34（54.0） 15（23.8） 5（7.9） 4（6.4） 5（7.9） 63（100.0） VS组 40（71.4） 3（5.4） 7（12.5） 4（7.1） 2（3.6） 56（100.0） Z 20.232 P < 0.001 * *P < 0.05 *。
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表 4 3种方法封闭剂保存率及龋齿发病率（%）
Table 4. The rate of sealant reservation and incidence of tooth decay among three groups （%）
复查时间 组别 复查牙数 保存牙数 保存率 患龋牙数 龋发病率 3个月 SO组 228 228 100.0 0 0.0 SS组 224 139 62.1△ 5 2.2 VS组 217 202 93.1△# 4 1.8 χ2 144.286 4.842 P < 0.001 * 0.089 6个月 SO组 224 220 98.2 4 1.8 SS组 216 113 52.3△ 9 4.2 VS组 213 189 89.2△# 7 3.3 χ2 159.703 2.153 P < 0.001 * 0.341 12个月 SO组 220 209 95.0 11 5.0 SS组 208 89 42.8△ 15 7.2 VS组 209 165 78.9△# 13 6.2 χ2 152.945 0.915 P < 0.001 * 0.613 *P < 0.05；与SO组比较， △P < 0.05；与SS组比较， #P < 0.05。
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