Observation on the Efficacy of Optimal Pulse Technology in the Treatment of Meibomian Gland Dysfunction Related Dry Eyes Based on in Vivo Confocal Microscopy Classification
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摘要:
目的 通过活体共聚焦显微镜（IVCM）对睑板腺功能障碍（MGD）分类，比较优化脉冲光技术（OPT）联合睑板腺按摩（MGX）治疗不同类型MGD相关干眼的疗效。 方法 选取2021年11月至2022年10月来昆明医科大学附属甘美医院门诊就诊的MGD相关干眼患者60例（60眼），通过IVCM检查睑板腺并将其分为严重程度增加阶段的3种类型：阻塞型29例，炎症型18例，纤维化型13例；均采用每2周1次，共3次的OPT联合MGX治疗。观察并记录3型患者在治疗前、治疗后1月、治疗后3月眼表疾病指数（OSDI）评分、非侵入泪膜破裂时间（NIBUT）、角膜荧光素钠染色（CFS）评分、脂质层厚度（LLT）、睑板腺分泌评分（MGYSS）的结果。 结果 （1）OSDI评分：3型治疗后1月、治疗后3月与治疗前比较OSDI评分均下降，阻塞型和炎症型治疗后1月与治疗后3月比较OSDI评分持续下降，治疗后1月阻塞型OSDI评分下降优于炎症型，治疗后3月阻塞型OSDI评分下降优于炎症型和纤维化型（P < 0.05）；（2）BUT：3型治疗后1月、治疗后3月与治疗前比较BUT均上升，阻塞型治疗后1月与治疗后3月比较BUT持续上升，治疗后1月和治疗后3月阻塞型BUT升高优于炎症型和纤维化型（P < 0.05）；（3）CFS评分：阻塞型治疗后1月、治疗后3月与治疗前比较CFS评分均下降，炎症型和纤维化型治疗后3月与治疗前比较CFS评分下降，差异有统计学意义（P < 0.05），治疗后3型组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；（4）LLT：阻塞型治疗后1月、治疗后3月与治疗前比较LLT上升，差异有统计学意义（P < 0.05），炎症型和纤维化型在治疗前后比较差异无统计学意义（P > 0.05），治疗后3型组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；（5）MGYSS：3型治疗后1月、治疗后3月与治疗前比较MGYSS均下降，3型治疗后1月与治疗后3月比较MGYSS持续下降，阻塞型治疗后1月和治疗后3月MGYSS下降优于炎症型和纤维化型（P < 0.05）；（6）IVCM分类的MGD严重程度增加的阶段与睑板腺缺失评分呈正相关（rs = 0.474，P < 0.001）。 结论 （1）通过ICVM对MGD分类，可将其分为严重程度增加阶段的3种类型：阻塞型、炎症型、纤维化型。IVCM对MGD分类是一种新分类方法，且IVCM分类的MGD严重程度增加的阶段与睑板腺缺失评分呈正相关。（2）在IVCM对MGD分类的基础上，通过OPT联合MGX治疗不同类型MGD相关干眼，阻塞型疗效更佳。 -
关键词:
- 睑板腺功能障碍相关干眼 /
- 活体共聚焦显微镜 /
- 分类 /
- 优化脉冲光 /
- 临床治疗效果
Abstract:Objective To classify the meibomian gland dysfunction （MGD） with the use of in vivo confocal microscopy （IVCM）, and to compare optimal pulse technology （OPT） combined with meibomian gland expression （MGX） in the treatment of different types of MGD-related dry eyes. Methods A total of 60 patients （60 eyes） with dry eyes associated with MGD were selected from November 2021 to October 2022 in Outpatient clinic of our hospital.The meibomian glands were examined by IVCM and divided into three types in the stage of increased severity: obstructive type （n = 29）, inflammatory type （n = 18） and fibrotic type （n = 13）. All patients were treated with OPT combined with MGX once every 2 weeks. The ocular surface disease index （OSDI） score, Noninvasive break-up time （NIBUT）, corneal fluorescein staining （CFS）, lipid layer thickness （LLT） and meibomian gland yielding secretion score （MGYSS） were observed and recorded before treatment, 1 month and 3 months after treatment. Results （1） OSDI score: The OSDI score of the three groups decreased 1 month and 3 months after treatment, and the OSDI score of obstructive type and inflammatory type decreased continuously 1 month after treatment compared with 3 months after treatment, the decrease of OSDI score of obstructive type was better than that of inflammatory type 1 months after treatment, and the decrease of OSDI score of obstructive type was better than that of inflammatory type and fibrotic type 3 months after treatment （P < 0.05）; （2） BUT: BUT of the three groups increased 1 month and 3 months after treatment, and the BUT of obstructive type increased continuously 1 month after treatment compared with 3 months after treatment, and the increase of BUT of obstructive type was better than that of inflammatory type and fibrotic type 1 month and 3 months after treatment （P < 0.05）; （3） CFS score:The CFS score of obstructive type decreased 1 month and 3 months after treatment, and the CFS score of inflammatory type and fibrotic type decreased 3 months after treatment, and the difference was statistically significant （P < 0.05）, There was no significant difference among the three types after treatment （P > 0.05）; （4） LLT: The LLT of obstructive type increased 1 month and 3 months after treatment, and the difference was statistically significant （P < 0.05）, There was no significant difference between inflammatory type and fibrotic type before and after treatment （P > 0.05）, There was no significant difference among the three types after treatment （P > 0.05）; （5） MGYSS:MGYSS of the three groups decreased 1 month and 3 months after treatment, and MGYSS decreased continuously in 1 month and 3 months after treatment in the three groups. the decrease of MGYSS in the obstructive type was better than that in the inflammatory type and fibrotic type （P < 0.05）; （6） According to IVCM classification, the stage of increased severity of MGD was positively correlated with the score of loss of meibomian gland （rs = 0.474, P < 0.001）. Conclusion （1） According to the classification of MGD by ICVM, it can be divided into three types in the stage of increased severity: obstruction type, inflammatory type and fibrotic type. IVCM is a new classification method for MGD, and according to IVCM classification, the stage of increased severity of MGD was positively correlated with the score of loss of meibomian gland; （2） On the basis of IVCM's classification of MGD, Treatment of different types of MGD-related dry eyes with OPT combined with MGX, The effect of obstruction type treatment is better. -
抗结核药物导致的肝损伤（anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATB-DILI）在临床中的发病率逐年升高，因肝损伤导致的肺结核患者停药比例居高不下，耐药风险也在逐步上升[1]。ATB-DILI患者是否有免疫功能低下，免疫功能变化是否与肝损伤密切相关，目前没有定论。血清淀粉蛋白酶A（serum amylase A，SAA）是临床常用炎症指标，正常人血液中SAA含量低，当机体受到炎症、感染、损伤、肿瘤等刺激，产生一系列细胞因子，促进SAA的表达[2]。
基质金属蛋白酶9（matrix mctalloprotcinase-9，MMP-9）与基质金属蛋白酶14（matrix mctalloprotcinase-14，MMP-14）是MMPs家族中的2种特异性蛋白水解酶，在炎症、肿瘤性疾病中可以受多种因素影响，发生内源性调控异常，导致其表达升高[3-4]。关于MMPs的研究方向主要为冠心病及肿瘤相关层面，MMPs是否与ATB-DILI发病机制有关，目前研究较少。本研究拟分析免疫功能、SAA、MMP-9、MMP-14在ATB-DILI患者中的表达情况，及与临床指标之间的关系，为发掘新的抗结核药物性肝损伤评估指标及影响因素奠定前期基础。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
选取于2019年7月至2020年7月就诊于昆明市第三人民医院的抗结核药物性肝损伤患者115例，按照指南[5]将不同临床类型的患者分为4组。即：肝细胞损伤型（A组）、胆汁淤积型（B组）、肝血管损伤（C组型）和混合型（D组）。随机选择同期门诊体检者35例作为健康对照（E组），所有研究均经医院伦理委员会批准（伦理编号201902313）。入组患者按照诊断标准及排除标准选取入组。患者组基本情况：男性患者67例，女性患者48例。年龄18～56岁，中位年龄32.3岁。患者组分组中A组男性40例，女性27例；B组男性10例，女性7例；C组男性10例，女性8例；D组男性7例，女性6例；健康对照组E组基本情况：男性20例，女性15例，年龄20～40岁，中位年龄26.5岁。各组总体比较，男女比例，差异无统计学意义（χ2 = 0.231，P > 0.05）。其余项目（年龄、身高、体重、体质指数）比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。
表 1 一般资料比较（$ \bar x \pm s $ ）Table 1. Comparison of general information （$\bar x \pm s $ ）项目 年龄（岁） 身高（cm） 体重（kg） 体质指数（kg/cm2） A组（n = 67） 39.1 ± 11.2 169.1 ± 5.7 57.3 ± 12.4 21.2 ± 2.3 B组（n = 17） 42.0 ± 7.0 167.2 ± 5.9 61.2 ± 11.7 19.8 ± 2.2 C组（n = 18） 37.1 ± 7.6 171.2 ± 6.6 60.5 ± 11.3 20.4 ± 2.1 D组（n = 13） 45.1 ± 8.2 166.2 ± 7.1 59.2 ± 9.7 20.1 ± 2.4 E组（n = 35） 34.1 ± 8.6 170.2 ± 6.1 67.2 ± 8.5 22.3 ± 1.3 F 0.349 0.647 0.672 0.565 P 0.943 0.633 0.541 0.690 1.2 诊断标准
（1）肺结核患者的诊断符合卫生部2018年版中华人民共和国卫生行业标准《肺结核诊断（WS288-2017）》的相关规定[6]；（2）抗结核药物性肝损伤的诊断：使用2HRZE/4HR抗结核治疗方案，在治疗过程中出现肝损伤，肝损伤的出现与抗结核药的使用直接相关，诊断标准符合中华医学会结核病学分会制定的《抗结核药物肝损伤诊治指南（2019版）》[5]。
1.3 纳排标准
纳入标准[5-6]：（1）符合上述诊断标准的各组人群；（2）年龄18～70岁；（3）首次发病就诊，检查资料完整；（4）签署知情同意书。
排除标准：（1）既往有各类型肝炎（乙肝、丙肝、自身免疫性肝病、酒精肝等）患者；（2）接受免疫调节治疗（包括激素、免疫抑制剂等）的疾病，如风湿免疫系统疾病等；（3）有各类导致免疫功能低下的疾病（肿瘤、糖尿病等）；（4）其他导致肝损伤的相关疾病。
1.4 抗结核药物性肝损伤的临床分型及严重程度分级
根据《抗结核药物肝损伤诊治指南（2019版）》来进行分型[5]。（1）肝细胞损伤型（A组）： ALT > 3倍ULN，且R≥5；（2）胆汁淤积型（B组）：ALP > 2倍ULN，且R≤2。（3）肝血管损伤型（C组）：ALT > 3倍ULN，R≥2；（4）混合型（D组）：ALT > 3倍ULN，ALP > 2倍ULN，且2 < R < 5。
1.5 抗结核药物性肝损伤的严重程度分级
（1）0级（无肝损伤）；（2）l级（轻度肝损伤）；（3）2级（中度肝损伤）；（4）3级（重度肝损伤）；（5）4级（急性肝功能衰竭）：可出现腹水、肝性脑病或与DILI相关的其他器官功能衰竭；（6）5级（致命）：因DILI致死，或需通过肝移植才能存活。
1.6 检查方法
收集研究对象晨起空腹静脉血6 mL，室温静置15～30 min，1100 r/min，离心半径为16.80 cm，离心15 min。血清MMP-9、MMP-14的浓度检测采用双抗体夹心法，MMP-9、MMP-14抗体购自abcam公司（货号分别为ab228402，ab5104）。酶标仪为美国Molecular公司SPECTCA MAX190。SAA采用化学发光法，试剂盒为美国罗氏试剂盒。
1.7 统计学处理
应用SPSS20.0软件分析统计，计量资料符合正态分布采用（
$\bar x \pm s $ ）表示，组间比较使用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。计数资料采用“构成比（%）”表示。相关性分析采用Spearman秩相关检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 免疫功能检查结果比较
比较不同亚组之间T淋巴细胞亚群细胞的计数，A组、B组、C组、D组分别与健康对照组（E组）比较，各组在CD3+、CD8+T淋巴细胞的计数上两两比较，差异无统计学意义（P > 0.05），CD4+T淋巴细胞计数A组、B组、C组、D组与E组比较，总体差异有统计学意义（P < 0.05），但组间比较，仅A组与E组差异有统计学意义（P < 0.05），见表2。
表 2 T淋巴细胞亚群细胞计数比较（$ \bar x \pm s $ ）Table 2. Comparison of cell counts of T lymphocyte subsets （$ \bar x \pm s $ ）项目 CD3计数（个） CD4计数（个） CD8计数（个） A组（n=67） 719 ± 110 455 ± 116 476 ± 89 B组（n = 17） 674 ± 89 566 ± 122 527 ± 87 C组（n = 18） 621 ± 78 521 ± 78 515 ± 103 D组（n = 13） 697 ± 82 559 ± 90 501 ± 91 E组（n = 35） 914 ± 170 810 ± 158 513 ± 85 F 0.775 6.784 0.446 P 0.550 0.000* 0.775 *P < 0.05。 2.2 SAA、MMP-9、MMP-14在不同类型肝损伤组别中的对照
分别比较SAA、MMP-9、MMP-14在A组、B组、C组、D组中的表达情况，与其他3组（B、C、D组）相比，SAA与MMP-9在A组中表达明显升高，差异具有统计学意义（P < 0.05），MMP-14在C组中表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05），见表3。
表 3 不同亚组SAA、MMP-9、MMP-14的比较（$\bar x \pm s $ ）Table 3. Comparison of SAA，MMP-9 and MMP-14 in different groups （$\bar x \pm s $ ）项目 SAA（mg/L） MMP-9（ng/mL） MMP-14（ng/mL） A组（n = 67） 89.1 ± 11.2 36.1 ± 10.2 5.2 ± 3.3 B组（n = 17） 32.3 ± 6.1 11.3 ± 6.2 6.0 ± 2.6 C组（n = 18） 47.5 ± 9.2 14.1 ± 7.1 11.2 ± 6.9 D组（n = 13） 55.2 ± 11.3 15.3/12.5 4.0 ± 2.1 F 4.432 5.414 3.996 P 0.012# 0.005# 0.018# #P < 0.05。 2.3 SAA、MMP-9、MMP-14与肝损伤严重程度的相关性分析
SAA的表达量与肝损伤严重程度分级呈正相关关系（r = 0.687，P = 0.001），MMP-9的表达量与肝损伤严重程度分级呈正相关关系（r = 0.811，P = 0.000），MMP-14的表达量肝损伤严重程度分级无相关关系（r = 0.075，P = 0.141），见表4。
表 4 SAA、MMP-9、MMP-14与肝损伤严重程度的比较（$ \bar x \pm s $ ）Table 4. Comparison of SAA，MMP-9，MMP-14 and the severity of liver injury （$ \bar x \pm s $ ）项目 1级（n = 41） 2级（n = 32） 3级（n = 25） 4级（n = 15） 5级（n = 2） Spearman系数（r） P SAA（mg/L） 26.1 ± 13.1 45.3 ± 15.2 69.2 ± 19.1 115.0 ± 21.3 146.0 ± 28.4 0.687# 0.001# MMP-9（ng/mL） 11.4 ± 5.1 39.1 ± 11.2 45.2 ± 10.4 55.1 ± 9.3 65.3 ± 21.1 0.811* 0.000* MMP-14（ng/mL） 3.61 ± 1.5 4.0 ± 1.2 4.01 ± 1.3 6.54 ± 2.3 8.21 ± 3.6 0.075 0.141 # P < 0.05，*P < 0.001。 3. 讨论
抗结核药物性肝损伤在临床中越来越常见，国内结核病研究专家已经开始呼吁临床医生重视ATB-DILI，因为ATB-DILI容易导致患者停药，使耐药风险增加，病程延长，治疗更为棘手[7]。
有研究结果显示，肺结核患者均有不同程度的免疫功能低下，同时免疫功能低下的患者，肺毁损及发生肺外结核的发生几率更高，提示肺结核疾病进展与免疫功能密切相关[8]。本研究结果显示，在临床研究数据对比中，肝细胞损伤型组（A组）与健康对照组（E组）在CD4+T淋巴细胞计数中两两比较，差异具有统计学意义（P < 0.05），提示ATB-DILI患者具有一定的免疫功能低下，CD4+T淋巴细胞减少可能对ATB-DILI发生有一定相关性，与部分文献相符[9-10]。同时肝细胞损伤型是ATB-DILI中最为常见的类型，CD4+T淋巴细胞减少也可能导致自身免疫屏障功能受损，巨噬细胞吞噬功能下降，炎症因子分泌增加，导致ATB-DILI进展[11-13]。
SAA是由多基因编码合成的一种急性时相反应蛋白[14]。其编码基因位于11号染色体短臂，大小约为160 kb[15]。本研究显示，SAA在ATB-DILI中明显升高，且与肝损伤严重程度密切相关（P < 0.05）。本研究结果提示ATB-DILI与炎症发生发展有一定相关性，抗结核药物导致的急性炎症反应会促进炎症因子分泌，攻击正常细胞结构，损伤肝细胞。通过抗结核治疗的同时应用保肝药如甘草酸单胺或异甘草酸镁等，控制炎症进程或者降低炎症因子表达，可能改善抗结核药物导致的肝损伤严重程度[16-17]。
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是自然界进化中高度保守的一类蛋白酶，所有MMPs亚型均属于锌依赖性内肽酶家族[18]。其中MMP-9主要在炎症细胞中表达，比如中性粒细胞、巨噬细胞等[19]。本研究显示在ATB-DILI患者中，MMP-9升高明显，提示ATB-DILI与炎症密切相关。同时MMP-9与ATB-DILI严重程度分级具有明显正相关关系（P < 0.05），MMP-9在ATB-DILI 3、4级患者中明显升高，提示ATB-DILI发生机制可能为炎症介质介导的炎症反应，该结论也与部分研究相符[20]。研究炎症反应导致的肝细胞损伤因素，分析炎症介质的上游通路及下游影响路径，可能为以后减少ATB-DILI发病率打下前期基础。
MMP-14是是第1个发现的具有跨膜序列的MMPs，并且是膜型蛋白酶中最重要的一员[21-22]。MMP-14主要生物学功能在于介导MMP-2酶原的激活，以及通过其表达上调血管内皮生长因子，促进血管生成和生长，也可促进血管内膜增厚，血管硬化及血管外间质增生[23-25]。本研究结果显示，MMP-14在肝血管损伤型中表达明显上升，提示血管损伤及硬化、肝纤维化与ATB-DILI发生机制也有一定相关性。虽然MMP-14与ATB-DILI严重程度无明显相关性（P > 0.05），但也可能与笔者入组病例较少，不能进行大样本分析有关。
通过本研究结果显示，SAA、MMP-9、MMP-14与ATB-DILI发生发展密切相关，通过调节炎症反应，减少炎症因子分泌，可能会降低ATB-DILI发病率，改善ATB-DILI患者预后，减少结核病患者的疾病负担。
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图 1 IVCM下一例阻塞型MGD相关干眼患者同一部位从睑板腺开口到穹窿部
A：上睑睑板腺；B：睑板腺开口边界欠光滑；C：睑板腺开口周边；D：睑板腺近开口处；E：睑板腺开口和穹窿部之间；F：睑板腺穹窿部。
Figure 1. IVCM shows a patient with dry eye associated with obstructive MGD from the meibomian gland opening to the fornix at the same site
图 2 IVCM检查的MGD分类的不同阶段
A：阻塞型；B：炎症型；C：纤维化型。
Figure 2. Different stages of MGD classification of IVCM examination
表 1 3型MGD相关干眼OSDI评分治疗前后及组间比较[（
$\bar x \pm s $ ），分]Table 1. Comparison of type 3 MGD related dry eye OSDI score before and after treatment and between groups [（
$\bar x \pm s $ ），points]组别 治疗前 治疗后1月 治疗后3月 F P 阻塞型 32.65 ± 8.87 19.80 ± 6.23 a 15.46 ± 6.82 a，c 111.505 < 0.001*** 炎症型 33.57 ± 8.59 26.37 ± 10.36 a 23.21 ± 11.53 a，c 25.412 < 0.001*** 纤维化型 30.05 ± 8.48 24.54 ± 9.48 a 25.06 ± 11.50 a 7.567 0.001* F
P0.648
0.5273.780
0.029*6.180
0.004*与治疗前比较，aP < 0.05；与治疗后1月比较，cP < 0.05；*P < 0.05，***P < 0.001。 
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表 2 3型MGD相关干眼BUT治疗前后及组间比较[（
$\bar x \pm s $ ），秒]Table 2. Comparison of type 3 MGD related dry eye BUT before and after treatment and between groups [（
$\bar x \pm s $ ），s]组别 治疗前 治疗后1月 治疗后3月 F P 阻塞型 5.81 ± 2.18 10.02 ± 2.74 a 13.75 ± 4.59 a，c 50.197 < 0.001*** 炎症型 6.07 ± 2.40 8.19 ± 2.90 a 9.07 ± 3.16 a 5.705 0.006* 纤维化型 5.94 ± 2.06 8.07 ± 1.96 a 8.59 ± 3.63 a 3.808 0.028* F 0.074 3.799 11.145 P 0.929 0.028* < 0.001*** 与治疗前比较，aP < 0.05；与治疗后1月比较，cP < 0.05；*P < 0.05，***P < 0.001。
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表 3 3型MGD相关干眼CFS评分治疗前后及组间比较[M（P25，P75），分]
Table 3. Comparison of type 3 MGD related dry eye CFS score before and after treatment and between groups [M（P25，P75），points]
组别 治疗前 治疗后1月 治疗后3月 Waldχ2 P 总体 0.00（0.00，2.00） 0.00（0.00，0.00） a 0.00（0.00，0.00） a 26.181 < 0.001*** 阻塞型 0.00（0.00，1.50） 0.00（0.00，0.00） a 0.00（0.00，0.00） a 9.369 0.009* 炎症型 0.00（0.00，2.00） 0.00（0.00，0.00） 0.00（0.00，0.00） a 9.000 0.011* 纤维化型 0.00（0.00，2.00） 0.00（0.00，0.00） 0.00（0.00，0.00） a 9.628 0.008 与治疗前比较，aP < 0.05；与治疗后1月比较，cP < 0.05；*P < 0.05，***P < 0.001。
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表 4 3型MGD相关干眼LLT治疗前后及组间比较[（
$\bar x \pm s $ ），nm]Table 4. Comparison of type 3 MGD related dry eye LLT score before and after treatment and between groups [（
$\bar x \pm s $ ），nm]组别 治疗前 治疗后1月 治疗后3月 F P 总体 66.92 ± 12.67 72.83 ± 13.82 a 74.60 ± 15.23 a 4.234 0.019* 阻塞型 65.41 ± 12.33 74.41 ± 12.16 a 76.90 ± 14.34 a 10.251 < 0.001*** 炎症型 67.72 ± 14.20 73.67 ± 13.32 74.33 ± 14.77 2.642 0.107 纤维化型 69.15 ± 11.73 68.15 ± 17.66 69.85 ± 17.73 0.096 0.814 与治疗前比较，aP < 0.05；与治疗后1月比较，cP < 0.05；*P < 0.05，***P < 0.001。
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表 5 3型MGD相关干眼MGYSS治疗前后及组间比较[（
$\bar x \pm s $ ），分]Table 5. Comparison of type 3 MGD related dry eye MGYSS score before and after treatment and between groups [（
$\bar x \pm s $ ） ，scores]组别 治疗前 治疗后1月 治疗后3月 F P 阻塞型 57.28 ± 16.56 44.48 ± 17.03 a 34.83 ± 14.79 a，c 74.809 < 0.001*** 炎症型 66.39 ± 10.26 58.33 ± 11.50 a 52.78 ± 11.79 a，c 16.250 < 0.001*** 纤维化型 65.00 ± 17.80 58.08 ± 15.48 a 53.46 ± 17.72 a，c 8.287 0.001* F 2.374 6.091 11.598 P 0.102 0.004* < 0.001*** 与治疗前比较，aP < 0.05；与治疗后1月比较，cP < 0.05；*P < 0.05，***P < 0.001。
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