Effects of Euonymine on Proliferation，Migration，and Cell Cycle of HUVECs and VSMCs
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摘要:
目的 探讨卫茅碱（Euonymine）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及人血管平滑肌细胞（VSMCs）的影响，以明确其防治冠脉支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）的可能机制。 方法 台盼蓝检测Euonymine对HUVECs成活率的影响；MTT法检测Euonymine对HUVECs及VSMCs增殖的影响；划痕法检测Euonymine对VSMCs迁移的影响。 结果 MTT结果显示，卫茅碱干预后, HUVECs和VSMCs的吸光度降低。另外，Euonymine分别作用HUVECs 24 h，VSMCs 48 h后，测的半数有效抑制浓度（IC50）分别为28.6 µg/mL和33.92 µg/mL。流式细胞结果显示，Euonymine（25 μg/mL）使HUVECs和VSMCs的细胞周期阻滞于G0/G1期，而Euonymine（100 µg/mL）使VSMCs有丝分裂被阻断于G0/G1期及G2/M期。 结论 Euonymine主要通过抑制VSMCs的增殖和迁移，影响细胞周期，对于抑制经皮冠状动脉介入治疗术（percutaneous coronary intervention，PCI）后新生内膜形成有潜在的临床应用价值。 Abstract:Objective To investigate the effects of Euonymine on isolated cultured human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） and human vascular smooth muscle cells （VSMCs）, so as to elucidate the possible mechanism of Euonymine in prevention and treatment of ISR. Methods The effect of trypan blue assay on the viability of HUVECs. MTT assay was used to observe the effect of Euonymine on the proliferation of normal HUVECs and VSMCs. A wound healing assay was performed to detect the effect of Euonymine on the migration of VSMCs. Results The MTT results showed that the absorbance of HUVECs and VSMCs decreased after the Euonymine intervention. In addition, the IC50 of Euonymine on HUVECs after 24 hours and on VSMCs after 48 hours were 28.6 µg/mL and 33.92 µg/mL, respectively. Flow cytometry results showed that Euonymine （25 μg/mL） arrested the cell cycle of both HUVECs and VSMCs at the G0/G1 phase, while Euonymine （100 μg/mL） blocked the mitosis of VSMCs at both the G0/G1 and G2/M phases. Conclusion Euonymine affects the cell cycle mainly by inhibiting the proliferation and migration of VSMCs and has potential value of clinical applications in inhibiting neointima hyperplasia after percutaneous coronary intervention （PCI）. -
Key words:
- Euonymine /
- HUVECs /
- VSMCs /
- Anti-proliferative /
- Anti-migratory /
- Cell cycle
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冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease，CAHD）是冠状动脉血管粥样硬化导致的血液循环障碍，以血管腔狭窄或阻塞为特征，致使心肌缺血、缺氧而引起的一系列临床症状，简称冠心病[1-2]。经皮冠状动脉介入治疗术（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前全球范围内应用最广泛的心肌再灌注疗法，可有效提高冠心病和心肌梗死患者的生存率，改善患者的生存质量[3-4]。然而，PCI术后新生内膜病理性增生，管腔直径的丢失而引起的支架内“再狭窄”（in-stent restenosis，ISR），严重影响其临床疗效及患者预后[5]。临床上常口服氯吡格雷和阿司匹林以防治支架内再狭窄的发生，虽然有一定疗效，但对ISR致急性冠脉事件发生的预后仍不乐观。
PCI术后的ISR 是血管对损伤的一种病理反应，支架扩张后造成的血管内皮细胞（vascular endothelial cells，VECs）损伤， VSMCs过度增殖、迁移而导致血管新生内膜形成，支架附近的血栓形成是导致ISR病程进展的3个主要原因[6-7]。冠脉支架植入后内皮细胞间连接受损，脂蛋白和单核细胞侵入内皮下，抗栓剂表达减少，一氧化氮（nitric oxide，NO）生成减少，屏障功能受损引发一系列复杂的事件，包括内皮剥脱、血栓前内膜暴露和随后的炎症、生长因子和细胞因子的释放、血小板活化及VSMCs增殖和迁移还能促进损伤部位的血栓形成[8-11]。综上，VECs的损伤是ISR的启动因素；VSMCs的过度增殖、迁移与凋亡不足造成支架内膜的逐渐增厚，演变为不稳定的动脉粥样硬化斑块，是ISR形成的中心环节；血管壁重构和局部血栓形成是ISR的最终结果。因此，关注VSMCs的增殖及迁移并尽快恢复VECs的活性将成为研究药物对ISR作用的关键靶标。
昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum （Levl） hutch，THH]属卫茅科雷公藤属植物，民间用于治疗类风湿性关节炎、肾小球肾炎等免疫系统疾病具有较好的临床疗效[12]。卫茅碱（Euonymine，C38H47NO18，分子量：805.783）是从THH根木中提取活性最高的雷公藤次碱化合物，见图1[13]。课题组前期研究发现，昆明山海棠提取物抑制VSMCs的增殖，提示昆明山海棠在PCI术ISR方面的具体机制有进一步深入研究的价值；而作为THH中活性最高的雷公藤次碱化合物卫茅碱，是否具有抗ISR的作用值得关注。因此，本实验培养与ISR密切相关的VSMCs和HUVECs，进一步探讨卫茅碱对VSMCs和HUVECs增殖、迁移及细胞周期的调控作用，为卫茅碱临床应用于涂层支架提供理论和实验依据。
1. 材料与方法
1.1 药物与试剂
卫茅碱由云南省中医药大学周志宏老师馈赠，纯度为98.8%；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），DMEM高糖培养基购自Gibico公司；0.25%胰酶购自BI公司；双抗青链霉素溶液购自Hyclone公司；DMSO购自Solarbio公司。
1.2 细胞系
HUVECs购自中国典型培养物保藏中心，人脐动脉来源VSMCs购自中国科学院昆明动物研究所。
1.3 仪器
CK-40显微镜购自Olympus公司，荧光显微镜购自尼康有限公司。
1.4 方法
1.4.1 卫茅碱的配制
用DMSO溶液完全溶解卫茅碱后，加入PBS配成2 mg/mL母液，临用前稀释成所需浓度。
1.4.2 台盼蓝检测卫茅碱对HUVECs成活率的影响
取HUVECs单细胞悬液，浓度106/mL移入EP管中，加入0.4%台盼蓝溶液后混匀，用血球计数板对拒染细胞和蓝染细胞计数，实验重复6次，取其平均值，求活细胞率[14]：
$$ {\text{活细胞率}}({\%}) = \frac{{\text{拒染细胞总数}}}{{\text{拒染细胞总数}} + {\text{蓝染细胞总数}}} \times 100{\%} $$ 1.4.3 MTT 法检测卫茅碱对HUVECs及VSMCs增殖的影响
实验分组如下：正常对照组（0.2%DMSO）、HUVECs及VSMCs实验组分别加入卫茅碱至终浓度为12.5，25，50，100 µg/mL。取第8代细胞制备悬液，培养箱中（37℃、5%CO2、95%湿度）孵育24 h后，弃液，无血清培养基同化24 h。加药前及加药后1 d、2 d、3 d及4 d各取一块板，实验结束前4 h加入20 µL MTT溶液，置于CO2培养箱孵育4 h后，每孔加入100 μL三联液，直到紫蓝色结晶溶解，放培养箱过夜。隔日在酶标仪波长570 nm处测OD值。计算细胞生长抑制率IR（%）[14]：
$$ {\text{生长抑制率}}=\frac{ {\text{实验组}}{\rm{OD}} {\text{值}}- {\text{空白组}}{\rm{OD}} {\text{值}}}{ {\text{对照组}}{\rm{OD}} {\text{值}}- {\text{空白组}}{\rm{OD}} {\text{值}}}\times 100\% $$ 1.4.4 迁移实验
实验分组如下：正常对照组（0.2%DMSO），模型组（20% FBS诱导），20%FBS + Euonymine 25 µg/mL，20%FBS + Euonymine 100 µg/mL。将VSMCs的悬浮液以5×104个/mL的比例放入Culture Insert-2 Wells（Ibidi，NO：81176，Martinsried，德国）中，在标准条件下培养24 h，根据制造商的说明移除插件，创造一个500 μm宽的无细胞空间（又称划痕），并在0 h时间点拍照。细胞迁移距离（d） = 0 h距离-24 h距离，单位μm。
1.4.5 流式细胞仪分析
将准备好的1×106个VSMCs细胞悬液以1000 r/min离心5 min，然后用PBS清洗。将细胞悬液在4℃下用70%的乙醇进行过夜固定，然后在4℃下用PBS洗涤2次；加入终浓度为50 mg/L的RNaseA，在37℃的水浴中孵育30 mins。用终浓度为50 mg/L的PI在4℃下孵育30 min。通过流式细胞仪测量荧光强度，并通过流式细胞仪分析DNA含量。
1.5 统计学处理
所有实验数据采用均数±标准差（
$\bar x \pm s $ ）表示，使用SPSS 19.0版统计软件包处理数据。各组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P < 0.05认为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 HUVEC和VSMCs的细胞培养结果
正常组HUVECs细胞贴壁生长，细胞呈梭形或不规则三角形，核清晰，呈圆形或椭圆形; 正常的VSMCs多数呈梭形或长梭形， “峰、谷”生长状态明显，见图2。
图 2 正常HUVECs和VSMCs形态（×100）A: 正常对照组HUVECs的形态；B: 正常对照组VSMCs的形态。Figure 2. Typical appearance of HUVECs and VSMCs （×100）2.2 Euonymine对HUVECs的存活率影响
将不同浓度的Euonymine（10，50，100 µg/mL）分别与HUVECs共同孵育后，实验结果提示Euonymine干预后，HUVECs的存活率降低，时效关系明显，见图3。不同浓度的Euonymine在72 h可使细胞存活率分别减少11.9%、22.4%和33.8% （P < 0.01）。
2.3 MTT法检测Euonymine对HUVECs及VSMCs增殖的影响
2.3.1 Euonymine抑制HUVECs增殖
分别用不同浓度的Euonymine（12.5，25，50，100 µg/mL）与HUVECs共同孵育后，MTT结果显示，不同浓度的Euonymine和对照组相比，OD值分别减少16.1%，25.0%，43.5%，87.0% （P < 0.01）。实验结果提示，Euonymine抑制HUVECs增殖，见表1。以HUVECs的生长抑制率对Euonymine浓度的自然对数值（LN）做量效Logistic回归分析（γ = 0.98，S = 7.59），求得Euonymine对HUVECs的生长抑制率曲线，IC50为28.6 µg/mL，见图4。
表 1 不同浓度Euonymine对HUVECs增殖的影响（$ \bar x \pm s $ ，n = 6）Table 1. Effect of different concentrations of Euonymine on the proliferation of HUVECs （$\bar x \pm s $ ，n = 6）分组 OD （570 nm） IR（%） F P 正常对照组 DMSO 0.768 ± 0.06 Euonymine（µg/mL） 12.5 0.654 ± 0.08△ 16.1 25 0.591 ± 0.19△ 25.0 5.97 0.030* 50 0.460 ± 0.07△ 43.5 100 0.152 ± 0.12△ 87.0 *P < 0.05；与正常对照组相比较，△P < 0.05。 
图 4 Euonymine作用HUVECs 24 h的生长抑制率曲线Figure 4. Curve inhibition rate of Euonymine treated HUVECs for 24 h2.3.2 Euonymine抑制VSMCs增殖
分别用不同浓度的Euonymine（12.5，25，50，100 µg/mL）与VSMCs共孵育2 d，与对照组相比，MTT提示各浓度OD值减少（P < 0.01），见表2。另外，Euonymine （25，50，100 μg/mL）对VSMCs的抑制率在96 h分别达到43.9%、63.2%、88.9%，见表2。以VSMCs的生长抑制率对Euonymine浓度的自然对数值（LN）做量效Logistic回归分析（γ = 0.99，S = 4.62），IC50为33.92 µg/mL，见图5。
表 2 不同浓度Euonymine对VSMCs增殖的影响（$\bar x \pm s$ ，n = 6）Table 2. Effect of different concentrations of Euonymine on the proliferation of VSMCs （$\bar x \pm s $ ，n = 6）分组 OD （570 nm） 24 h 48 h 72 h 96 h 正常对照组 DMSO 0.788 ± 0.16 0.841 ± 0.14 0.885 ± 0.08 0.925 ± 0.20 Euonymine
（µg/mL）12.5 0.688 ± 0.10 0.680 ± 0.13 0.676 ± 0.12△ 0.637 ± 0.04 25 0.626 ± 0.08△ 0.628 ± 0.19△ 0.607 ± 0.10△ 0.569 ± 0.12△ 50 0.524 ± 0.11△ 0.425 ± 0.15△ 0.419 ± 0.07△ 0.402 ± 0.18△ 100 0.312 ± 0.07△ 0.259 ± 0.13△ 0.219 ± 0.17△ 0.188 ± 0.08△ 200 0.259 ± 0.04△ 0.185 ± 0.16△ 0.156 ± 0.06△ 0.137 ± 0.18△ F 6.21 6.49 6.61 6.76 P 0.041* 0.041* 0 .031* 0.028* *P < 0.05；与正常对照组比较，△P < 0.05。 
图 5 Euonymine作用VSMCs 48 h的生长抑制率曲线Figure 5. Curve inhibition rate of Euonymine treated VSMCs for 48 h2.4 Euonymine抑制VSMCs迁移
迁移实验结果显示，各实验组的迁移距离分别是：正常对照组 （77.33±9.02） μm，模型组（260.05±26.12） μm，Euonymine 25 µg/mL组（189.36±15.68） μm，Euonymine 100 µg/mL（135.33±11.04 ）μm。实验结果提示，与模型组相比，不同浓度的Euonymine均抑制VSMCs迁移（P < 0.01），见图6。
图 6 卫茅碱抑制VSMCs迁移A：划痕实验24 h后各实验组 VSMCs迁移的图像；B：Euonymine抑制VSMCs迁移距离的统计分析。与正常对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05（$ \bar x \pm s $ Figure 6. Euonymine inhibits the migration of VSMCs2.5 Euonymine对细胞周期的影响
2.5.1 Euonymine对血清诱导的HUVECs的细胞周期影响
实验结果显示，与模型组相比，低剂量Euonymine组（25 µg/mL）升高G0/G1期的细胞，而降低S期和G2/M期的细胞数；高剂量Euonymine组（100 µg/mL）S期细胞数进一步减少，G2/M期细胞数减少（P < 0.01）。结果提示，Euonymine干预后， HUVECs有丝分裂被阻断于G0/G1期（P < 0.01），见图7。
图 7 卫茅碱对血清诱导的HUVECs细胞周期影响（$ \bar x \pm s$ ，n = 6）A～C：不同浓度的Euonymine作用HUVECs后24 h的DNA直方图； D： Euonymine处理24 h的HUVECs的细胞周期的统计学分析。Figure 7. Effect of Euonymine on the cell cycle of HUVECs induced by serum （$ \bar x \pm s$ ，n = 6）2.5.2 Euonymine对血清诱导的VSMCs细胞周期影响
实验结果显示，与模型组相比，Euonymine 25 µg/mL升高G0/G1期的细胞数，而降低S期和G2/M期的细胞数；100 µg/mL组S期细胞数进一步减少，G0/G1期、G2/M期细胞数增多（P < 0.01）。实验结果提示，低剂量Euonymine组使VSMCs有丝分裂停滞于G0/G1期，而高剂量Euonymine组VSMCs有丝分裂阻滞于G0/G1期和G2/M期；将药物作用时间延长至 48 h，实验结果和24 h趋势保持一致，见图8。
图 8 Euonymine对血清诱导的VSMCs细胞周期影响（$\bar x \pm s $ ，n = 6）A～C：不同浓度的Euonymine作用VSMC后24 h的DNA直方图；D～E： Euonyming处理24 h和48 h的VSMCs的细胞周期分布。Figure 8. Effect of Euonymine on the cell cycle of VSMCs induced by serum （$\bar x \pm s $ ，n = 6）3. 讨论
PCI术后ISR是一个多因素多环节参与的复杂病理生理过程。冠脉支架植入后可导致VECs损伤，促进血管收缩，启动一系列血管损伤和炎症反应，还能促进损伤部位的血栓形成[15-19]。因此，VECs的损伤是ISR的启动因素；VSMCs的过度增殖、迁移与凋亡造成支架内膜的逐渐增厚，是ISR形成的中心环节。目前，可供临床使用的支架涂层药物很少，包括紫杉醇和雷帕霉素及其衍生物，这些支架涂层药物降低了支架内再狭窄率，但内皮延迟愈合和支架内血栓形成增加等主要不良后果严重降低了其治疗效果[20]。
本实验将卫茅碱作为研究材料，检测其对HUVECs和VSMCs增殖的影响，探讨其在防治PCI术后ISR中的潜在作用机制。本实验首先观察卫茅碱对 HUVEC和VSMCs 活性的影响。 从MTT 法测定结果来看，卫茅碱可抑制HUVECs和 VSMCs增殖，IC50 分别为28.6 µg/mL和33.92 µg/mL。接着笔者研究了卫茅碱对VSMCs迁移影响。结果表明，与模型组相比，卫茅碱在各个时间点对VSMCs的迁移距离有明显的抑制作用（P < 0.01），高剂量卫茅碱对VSMC的迁移抑制率最高达到79.1%。
细胞周期作为增殖信号转导的最终共同路径，细胞周期的推进在血管增生性疾病中起着关键作用[21-29]。为此笔者同时检测了卫茅碱对HUVECs和VSMCs的细胞周期的影响。流式结果表明，HUVECs与卫茅碱共孵育24 h，低剂量卫茅碱组（25 µg/mL）使G1/G0期细胞增加，S期及G2/M期细胞减少（P < 0.01），随着卫茅碱浓度增加到100 µg/mL，G1/G0期细胞增加明显，S期及G2/M期细胞减少，提示卫茅碱抑制HUVECs增殖可能主要通过抑制细胞周期由G1/G0期向S期过渡，使之停滞于细胞周期的G1/G0期。同时笔者观察到VSMCs经卫茅碱处理24 h 时，低剂量卫茅碱（25 μg/mL）主要阻滞细胞于G0/G1 期，而高剂量卫茅碱则阻滞于G0/G1及G2/M 期，延长卫茅碱与VSMCs的孵育时间到72 h ，不同剂量组VSMCs均体现为G2/M 期阻滞，且剂量依赖性明显。因此，卫茅碱抑制VSMCs 的增殖作用可能与其引起细胞G0/G1和G2/M 期阻滞密切相关。
综上所述，卫茅碱主要通过抑制VSMCs的增殖和迁移，同时影响细胞周期，对于抑制PCI术后ISR的形成有潜在的临床应用价值，但其对HUVECs亦有非选择性的抑制作用，其机理可能与其抑制HUVEC细胞周期的G1/G0期向S期过渡，使之停滞于细胞周期的G1/G0期有关。
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图 2 正常HUVECs和VSMCs形态（×100）
A: 正常对照组HUVECs的形态；B: 正常对照组VSMCs的形态。
Figure 2. Typical appearance of HUVECs and VSMCs （×100）
图 4 Euonymine作用HUVECs 24 h的生长抑制率曲线
Figure 4. Curve inhibition rate of Euonymine treated HUVECs for 24 h
图 5 Euonymine作用VSMCs 48 h的生长抑制率曲线
Figure 5. Curve inhibition rate of Euonymine treated VSMCs for 48 h
图 6 卫茅碱抑制VSMCs迁移
A：划痕实验24 h后各实验组 VSMCs迁移的图像；B：Euonymine抑制VSMCs迁移距离的统计分析。与正常对照组比较，**P < 0.01；与模型组比较，#P < 0.05（$ \bar x \pm s $，n = 6）。
Figure 6. Euonymine inhibits the migration of VSMCs
图 7 卫茅碱对血清诱导的HUVECs细胞周期影响（
$ \bar x \pm s$ ，n = 6）A～C：不同浓度的Euonymine作用HUVECs后24 h的DNA直方图； D： Euonymine处理24 h的HUVECs的细胞周期的统计学分析。
Figure 7. Effect of Euonymine on the cell cycle of HUVECs induced by serum （
$ \bar x \pm s$ ，n = 6）
图 8 Euonymine对血清诱导的VSMCs细胞周期影响（
$\bar x \pm s $ ，n = 6）A～C：不同浓度的Euonymine作用VSMC后24 h的DNA直方图；D～E： Euonyming处理24 h和48 h的VSMCs的细胞周期分布。
Figure 8. Effect of Euonymine on the cell cycle of VSMCs induced by serum （
$\bar x \pm s $ ，n = 6）表 1 不同浓度Euonymine对HUVECs增殖的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n = 6）Table 1. Effect of different concentrations of Euonymine on the proliferation of HUVECs （
$\bar x \pm s $ ，n = 6）分组 OD （570 nm） IR（%） F P 正常对照组 DMSO 0.768 ± 0.06 Euonymine（µg/mL） 12.5 0.654 ± 0.08△ 16.1 25 0.591 ± 0.19△ 25.0 5.97 0.030* 50 0.460 ± 0.07△ 43.5 100 0.152 ± 0.12△ 87.0 *P < 0.05；与正常对照组相比较，△P < 0.05。 
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表 2 不同浓度Euonymine对VSMCs增殖的影响（
$\bar x \pm s$ ，n = 6）Table 2. Effect of different concentrations of Euonymine on the proliferation of VSMCs （
$\bar x \pm s $ ，n = 6）分组 OD （570 nm） 24 h 48 h 72 h 96 h 正常对照组 DMSO 0.788 ± 0.16 0.841 ± 0.14 0.885 ± 0.08 0.925 ± 0.20 Euonymine
（µg/mL）12.5 0.688 ± 0.10 0.680 ± 0.13 0.676 ± 0.12△ 0.637 ± 0.04 25 0.626 ± 0.08△ 0.628 ± 0.19△ 0.607 ± 0.10△ 0.569 ± 0.12△ 50 0.524 ± 0.11△ 0.425 ± 0.15△ 0.419 ± 0.07△ 0.402 ± 0.18△ 100 0.312 ± 0.07△ 0.259 ± 0.13△ 0.219 ± 0.17△ 0.188 ± 0.08△ 200 0.259 ± 0.04△ 0.185 ± 0.16△ 0.156 ± 0.06△ 0.137 ± 0.18△ F 6.21 6.49 6.61 6.76 P 0.041* 0.041* 0 .031* 0.028* *P < 0.05；与正常对照组比较，△P < 0.05。
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