Study on the Regulatory Mechanism of Inhibiting miR-153-3p to Delay Intervertebral Disc Degeneration via Nrf2 Regulation
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摘要:
目的 探讨人髓核细胞中miR-153-3p与Nrf2表达与椎间盘退变的相关机制。 方法 以H2O2构建髓核细胞氧化损伤模型，将miR-153-3p inhibitor-NC、si-Nrf2-NC 、miR-153-3p inhibitor、si-Nrf2 按分组转染至髓核细胞，利用RT-qPCR和western blot实验检测转染效率，采用CCK-8法检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞内活性氧ROS 水平、线粒体膜电位下降的比值；RT-qPCR检测Nrf2、MMP-3、Col-Ⅱ、PINK1、Parkin、p62、p38 MAPK的表达量，双荧光素酶报告实验测量荧光素酶活性。 结果 （1）经H2O2处理的HNPCs细胞活力下降及线粒体膜电位降低、ROS水平提高、Col-Ⅱ表达减少，MMP-3、P62、p38 MAPK表达均升高，PINK1、Parkin表达均降低（P < 0.05），Nrf2无明显变化（P > 0.05）。（2）抑制经H2O2处理的髓核细胞miR-153-3p表达，其细胞活力及线粒体膜电位提高、ROS水平下降、Col-Ⅱ表达增加， MMP-3、P62、p38 MAPK表达均降低；而PINK1、Parkin及Nrf2表达均升高（P < 0.05）。（3）抑制经H2O2处理的髓核细胞miR-153-3p表达，同时沉默Nrf2表达，可见细胞活力及线粒体膜电位下降、ROS水平升高、Col-Ⅱ表达减少，且其MMP-3、P62、p38 MAPK表达升高；Nrf2、PINK1、Parkin 表达降低（P < 0.05）。（4）双荧光素酶活性分析显示miR-153-3p与 Nrf2间存在结合位点和结合关系，关系呈负相关（P < 0.05）。 结论 抑制miR-153-3p表达可缓解H2O2诱导的髓核细胞退变和纤维化，激活受损髓核细胞自噬、延缓髓核细胞凋亡，这一作用与Nrf2调控PINK1/Parkin途径、p38 MAPK炎性反应通路相关。 -
关键词:
- 椎间盘退变 /
- 人髓核细胞 /
- miR-153-3p /
- Nrf2
Abstract:Objective To investigate the correlation mechanism between miR-153-3p and Nrf2 expression in human nucleus pulposus cells and intervertebral disc degeneration （IDD）. Methods The oxidative damage model of nucleus pulposus cells was duplicated induced by H2O2. MiR-153-3p inhibitor-NC, si-NRF2-NC, miR-153-3p inhibitor, and si-NRF2 were transfected into nucleus pulposus cells according to the grouping require. The transfection efficiency was detected by RT-qPCR and western blot. The cell viability was determined by the CCK-8 assay, when the intracellular reactive oxygen species （ROS） levels and the ratio of mitochondrial membrane potential decline were measured by flow cytometry, RT-qPCR was used to detect the expression levels of Nrf2, MMP-3, Col II, PINK1, Parkin, P62, and p38 MAPK. And dual luciferase reporter assay was used to measure luciferase activity. Results （1） HNPCs treated with H2O2 showed a decrease in HNPCs cell viability, a reduction in mitochondrial membrane potential, an increase in ROS levels, and a decrease in Col II expression （P < 0.05）. And the expression of MMP-3, P62, and p38 MAPK increased, while the expression of PINK1 and Parkin decreased. There was no significant change in Nrf2（P > 0.05）. （2） Inhibition of miR-153-3p expression in nucleus pulposus cells treated with H2O2 led to increased cell viability, elevated mitochondrial membrane potential, reduced ROS levels, and enhanced Col-II expression, accompanied by decreased expression of MMP-3, P62, and p38 MAPK, while simultaneously increasing the expression of PINK1, Parkin, and Nrf2 （P < 0.05）. （3） When miR-153-3p expression was inhibited and Nrf2 expression was silenced in nucleus pulposus cells treated with H2O2, a notable decline in cell viability and mitochondrial membrane potential was observed, along with a marked increase in ROS levels. Additionally, Col-II expression decreased, whereas the expression of MMP-3, P62, and p38 MAPK increased. However, the expression of Nrf2, PINK1, and Parkin decreased （P < 0.05）. （4） Dual-luciferase assay analysis revealed binding sites and a binding relationship between miR-153-3p and Nrf2, indicating a negative correlation between miR-153-3p and Nrf2 （P < 0.05）. Conclusion Inhibition of miR-153-3p expression can alleviate H2O2 induced degeneration and fibrosis of nucleus pulposus cells, activate autophagy of damaged nucleus pulposus cells, and delay apoptosis of nucleus pulposus cells. This effect is related to the PINK1/Parkin pathway and p38 MAPK inflammatory response pathway regulated by Nrf2. -
Key words:
- Intervertebral disc degeneration /
- Human nucleus pulposus cells /
- miR-153-3p /
- Nrf2
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阿奇霉素(Azithromycin)是一种大环内酯类广谱抗生素，基于红霉素结构上润饰得到，解决了红霉素因酸缩酮化形成8,9-脱水红霉素-6,9-半缩酮而失效的问题，在提高血药浓度的同时增强了抗感染疗效，延长了药物的半衰期，降低了药物相关的反作用，是临床上常用的抗生素药物[1]。1991年，辉瑞公司生产的阿奇霉素首次在美国获批上市，商品名“希舒美（Zithromax）”，上市以来长久作为畅销药。该药物通过窒碍细菌转肽过程，与细菌核蛋白体的50S亚基结合，抑制了相应细菌蛋白质的合成[2]，从而抑制细菌的生长繁殖。阿奇霉素除了可以用于急性咽炎、急性扁桃体炎、细菌引起的中耳炎和肺炎外，也可用于皮肤软组织感染和淋病、生殖道衣原体感染等疾病的治疗，有研究证实异维A酸联合阿奇霉素和阿达帕林凝胶对改善中重度痤疮患者的皮肤屏障功能临床疗效较好，且未出现不良反应发生率增加的现象[3]，而在近年流行的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)的治疗中，阿奇霉素体现出了较好的抗炎症和相关的免疫调节作用[4]，有坦桑尼亚学者通过回顾性研究发现在COVID-19疫情期间阿奇霉素的使用量增加了163.79%[5]。随着临床应用范围的扩大，有关于阿奇霉素相关不良反应的报道屡见不鲜，甚至出现致死的严重结局[2]，过去也有许多学者基于某市自发呈报的药品不良反应监测数据[6]或某医院临床用药不良反应监测数据[7]对阿奇霉素引发的药品不良反应进行回顾性分析，但其中可能存在着研究范围和研究数据的受限。因此，本研究通过对美国食品药品监督管理局不良事件报告系统（FDA adverse events reporting system，FAERS）数据库中的信号进行深入挖掘和梳理，为保障临床用药的安全性提供参考。
1. 资料与方法
1.1 数据的获取与处理
FAERS数据库是由美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）创建和维护的用于监测在美国销售的药物和生物制剂的安全性的公开报告系统，其中包括有关药物的不良报告和错误用药信息[8]。本研究以阿奇霉素的通用名“Azithromycin”为目标药物名称进行检索，运用OpenVigil 2.1分析工具（https://openvigil.sourceforge.net/）提取了FAERS数据库中2003年10月1日至2023年10月1日的不良事件（adverse events，ADE）报告，并分别设定过滤条件为患者性别、年龄、上报国家、危险结局以获取相应数据。排除信息不完整、错误、重复和非不良事件的报告。
1.2 数据标准化
本研究使用Microsoft Excel 2019软件，以《国际医学用语词典》（medical dictionary for regulatory activities，MedDRA）25.1版[9]的ADE术语集中的首选系统器官分类（system organ class，SOC）和首选术语（preferred terms，PT）为标准对纳入的ADE报告进行标准化阐述和分类[10]。
1.3 统计学分析
本研究重点应用比例失衡法中常使用的报告比值法（reporting odds ratio，ROR）和贝叶斯置信区间神经传播网络法（bayesian confidence propagation neural network，BCPNN）进行检测，比例失衡法是目前广泛应用的检测方法，用于分析目标药物与目标ADE之间的潜在关系[11]，这两种方法均基于经典的比例失衡法的4格表，见表1。ROR法基于计算公式得出ROR值及其95%置信区间下限（95%CI），若报告数≥3且95%CI>1可认定1个阳性信号；BCPNN法基于公式计算出信息成分（information component，IC）及其95%置信区间下限（IC025），若报告数≥3且IC025 >0可认定1个阳性信号，本研究将两种算法均认定为阳性的信号纳入分析[12-13]。采用Microsoft Excel 2019软件完成数据的处理与排序。
表 1 经典的比例失衡法的4格表Table 1. Four-by-four table for the classical method of proportion unbalance项目 目标ADE报告数 其他ADE报告数 合计 目标药物 a b a+b 其他药物 c d c+d 合计 a+c b+d a+b+c+d ROR法的计算公式如下：
$$ \begin{gathered} ROR = \dfrac{{\frac{{\text{a}}}{b}}}{{\frac{c}{d}}} = \frac{{ad}}{{bc}} \\ 95\% CI = {e^{\ln （ROR） \pm 1.96\sqrt {\left(\tfrac{1}{a} + \tfrac{1}{b} + \tfrac{1}{c} + \tfrac{1}{d}\right)} }} \\ \end{gathered} $$ BCPNN法的计算公式如下：
$$ \begin{array}{l}n=a+b+c+d\\ IC={\mathrm{log}}_{2}\dfrac{a(n)}{(a+b)(a+c)}\\ \gamma ={\gamma }_{11}\dfrac{(n+\alpha )(n+\beta )}{(a+b+{\alpha }_{1})(a+c+{\beta }_{1})}\\ E(IC)={\mathrm{log}}_{2}\dfrac{(\alpha +{\gamma }_{11})(n+\alpha )(n+\beta )}{(n+\gamma )(a+b+{\alpha }_{1})(a+c+{\beta }_{1})}\\ \begin{array}{l} V(IC) = \dfrac{1}{{{{({\rm{ln}}2)}^2}}}\left\{ {\left[ {\dfrac{{n - \alpha + \gamma - {\gamma _{11}}}}{{(a + {\gamma _{11}})(1 + n + \gamma )}}} \right]} \right. + \\ \left[ {\dfrac{{n - \left( {{\rm{a}} + b} \right) + \alpha - {\alpha _1}}}{{(a + b + {\alpha _1})(1 + n + \alpha )}}} \right] + \left. {\left[ {\dfrac{{n - \left( {{\rm{a}} + c} \right) + \beta - {\beta _1}}}{{(a + c + {\beta _1})(1 + n + \beta )}}} \right]} \right\} \end{array} \\ IC025=E(IC)-2\sqrt{V(IC)}\\ 其中{\alpha }_{1}={\beta }_{1}=1，\alpha =\beta =2，{\gamma }_{11}=1 。\end{array} $$ 2. 结果
2.1 阿奇霉素的ADE报告基本情况
从FAERS数据库检索获取到阿奇霉素ADE信号
5498 个，总报告数量为112485 份，自FAERS数据库存有数据以来，阿奇霉素每年的ADE报告数呈波动变化，其中2021年的增长率最大，达到了594.02%，见图1。因2003年和2023年并非全年数据，因此，未计算2004年和2023年的报告数增长率。研究最终纳入有效ADE报告
31041 份，其中女性报告数占比（58.17%）高于男性（33.08%）；从年龄上看，61岁及以上的报告数占比最多（22.46%），其次是46～60岁（21.35%）；从报告国家看，美国提交的报告数最多（43.92%）；从严重ADE结局看，死亡、残疾、危及生命、住院治疗的报告共有19616 份，占比约63.20%，其中以不良事件导致住院治疗占比最多（45.29%），基本信息见表2。表 2 阿奇霉素的ADE报告基本信息表Table 2. Basic information for ADE report on Azithromycin项目 例数（n） 总数（n） 占比（%） 性别 男性 10269 31041 33.08 女性 18055 31041 58.17 不明或缺失 2717 31041 8.75 年龄（岁） 0～18 1953 31041 6.29 19～45 5411 31041 17.43 46～60 6628 31041 21.35 ≥61 6973 31041 22.46 不明或缺失 10076 31041 32.46 国家 美国 13632 31041 43.92 中国 547 31041 1.76 澳大利亚 249 31041 0.80 法国 1012 31041 3.26 英国 526 31041 1.69 印度 119 31041 0.38 其他 14956 31041 48.18 结局 死亡 2536 31041 8.17 残疾 999 31041 3.22 危及生命 2023 31041 6.52 住院治疗 14058 31041 45.29 其他 11425 31041 36.80 2.2 各PT分类的ADE报告及信号情况
本研究通过两种方法筛选得到898个有效信号，报告频次排名前30位的ADE信号见表3，排名前3位的分别为药物性超敏反应、咳嗽和慢性肾脏疾病；采用ROR值的95%CI下限大小能反映药物与ADE信号之间相关性的强弱，其数值越大，信号强度越强，关联性也就越强[14]，信号强度排名前30位的ADE信号，见表4，关联性排名前3位的不良事件分别为NPM1基因突变、先天性裂孔疝和鼻窦息肉变性。
表 3 报告频次排名前30位的ADE信号Table 3. Top 30 ADE signals by reporting frequencyPT 频次 ROR（95%CI） 药物性超敏反应 2334 8.23（8.59，7.89） 咳嗽 1057 3.6（3.82，3.38） 慢性肾脏疾病 954 7.31（7.80，6.85） 哮喘* 862 7.63（8.17，7.13） 药物相互作用 799 4.25（4.57，3.96） 急性肾损伤 791 4.46（4.79，4.15） 荨麻疹 650 3.42（3.69，3.16） 哮鸣* 646 11.27（12.19，10.41） 心电图 QT 间期延长 471 9.95（10.91，9.08） 孕产妇在妊娠过程中的暴露* 467 4.44（4.87，4.05） 胸部不适 438 3.98（4.38，3.62） 胃食管反流病* 422 4.72（5.20，4.29） 妊娠过程中胎儿暴露* 419 3.5（3.86，3.18） 早产儿 378 8.21（9.10，7.41） 对非适应症用药无效 378 5.72（6.34，5.17） 治疗产品效果不全 324 3.89（4.35，3.49） 全血细胞计数异常 312 8.83（9.89，7.89） 咳痰 295 6.98（7.83，6.21） 分娩提前* 285 13.23（14.89，11.75） 日常活动自理能力丧失* 283 6.1（6.86，5.42） 流涕 258 3.69（4.17，3.26） 终末期肾脏疾病 249 8.28（9.40，7.30） 黄斑变性* 240 18.54（21.11，16.29） 鼻充血* 238 3.83（4.35，3.37） 耳鸣 216 3.94（4.50，3.44） 上呼吸道感染* 215 4.58（5.24，4.00） 史蒂文斯-约翰逊综合征 212 6.71（7.69，5.86） 慢性阻塞性肺疾病* 205 3.46（3.97，3.01） 咯血* 200 6.6（7.60，5.74） 嗜酸粒细胞增多症 197 10.89（12.55，9.45） *表示该不良反应为在药品说明书上未标注的不良反应。 表 4 信号强度排名前30位的ADE信号Table 4. Top 30 ADE signals in terms of signal strengthPT 频次 ROR（95%CI） NPM1 基因突变 11 1516.77 （5437.19 ，423.12）先天性裂孔疝 10 1378.84 （5010.43 ，379.45）鼻窦息肉变性 7 1447.62 （6968.94 ，300.71）支气管良性肿瘤 6 1240.78 （6147.92 ，250.41）掌腱膜挛缩症手术治疗 10 590.93（ 1552.57 ，224.92）支气管吻合处并发症 7 723.81（ 2472.74 ，211.87）肌阵挛性肌张力障碍 12 354.58（766.70，163.99） 椎体终板炎症 4 827.13（ 4516.12 ，151.49）肠系膜上动脉夹层 6 496.31（ 1626.36 ，151.46）FEV1/FVC 比率异常 8 367.66（953.01，141.84） 嗅觉生殖器发育不全 3 1240.65 （11927.84 ，129.04）感染性软骨炎 5 413.58（ 1428.69 ，119.72）门脉高压性肠病 3 620.32（ 3712.67 ，103.65）真菌病原体携带者 13 185.45（356.77，96.40） 肺弥散功能疾病 21 152.46（251.47，92.43） 异源嵌合型 11 151.68（302.69，76.00） 上呼吸道坏死 4 236.32（807.34，69.18） 嗜血杆菌性支气管炎 6 177.25（461.29，68.11） 细菌性心包炎 9 137.88（293.20，64.84） 肺功能检查异常 118 74.46（90.61，61.19） 皮肤黏膜疾病 17 99.07（168.20，58.35） 通气/血流比例失调 22 81.29（128.41，51.46） 不全流产 132 55.67（66.78，46.40） 右室收缩压 3 177.24（685.44，45.83） 鼻息肉 152 52.22（61.84，44.10） 婴儿急性出血性水肿 5 114.88（309.45，42.65） 单纯疱疹病毒血症 10 78.05（153.42，39.70） 巴贝西虫病 17 62.25（103.66，37.38） 鸟结核分枝杆菌
免疫复合修复病3 137.85（509.22，37.32） 耳瘙痒 131 43.19（51.72，36.06） 2.3 阿奇霉素ADE信号SOC分类结果
将得到的ADE有效信号按照MedDRA 25.1版的标准SOC进行分类[15]，对应SOC分类27个，见表5，信号数排名前3位的SOC为呼吸系统胸及纵膈疾病（139个）、感染及侵染类疾病（110个）、各类检查（96个）；报告数构成比排名前3的SOC为呼吸系统、胸及纵隔疾病（23.42%）、免疫系统疾病（13.73%）、各类检查（8.03%）。此外，研究还筛选出了出现频率较高的50个在药品说明书未提及的可疑不良反应，其中累计阳性报告
1035 个、SOC种类13个，报告数排名前3的PT为良性、恶性及性质不明的肿瘤（包括囊状和息肉状）中的鼻息肉（152个）、各类检查中的胸部X线检查异常（140个）、妊娠期、产褥期及围产期状况中的不全流产（132个），见表6。表 5 SOC分类信号数、报告数、构成比情况Table 5. Classification of SOC signals，number of reports，composition ratioSOC 信号数（n） 报告数（n） 构成比（%） 呼吸系统、胸及纵隔疾病 139 7271 23.42 免疫系统疾病 42 4261 13.73 各类检查 96 2493 8.03 肾脏及泌尿系统疾病 18 2344 7.55 全身性疾病及给药部位各种反应 39 2223 7.16 妊娠期、产褥期及围产期状况 26 1897 6.11 感染及侵染类疾病 110 1417 4.56 肝胆系统疾病 36 1321 4.26 心脏器官疾病 34 1161 3.74 胃肠系统疾病 52 941 3.03 皮肤及皮下组织类疾病 38 872 2.81 眼器官疾病 28 732 2.36 各类神经系统疾病 33 558 1.80 精神病类 28 555 1.79 血液及淋巴系统疾病 23 480 1.55 耳及迷路类疾病 15 480 1.55 代谢及营养类疾病 14 384 1.24 社会环境 4 381 1.23 血管与淋巴管类疾病 40 331 1.07 良性、恶性及性质不明的
肿瘤（包括囊状和息肉状）8 225 0.72 各类损伤、中毒及操作并发症 13 192 0.62 产品问题 4 104 0.34 各种肌肉骨骼及结缔组织疾病 17 101 0.33 生殖系统及乳腺疾病 12 98 0.32 各种手术及医疗操作 14 90 0.29 内分泌系统疾病 5 73 0.24 各种先天性家族性遗传性疾病 10 56 0.18 表 6 可疑不良反应表Table 6. Suspicious adverse reactionsSOC PT（报告数） 感染及侵染类疾病 感染性软骨炎*（5）、真菌病原体携带者*（13）、细菌性心包炎*（9）、单纯疱疹病毒血症*（10）、鸟结核分枝杆菌免疫复合修复病*（3）、鼻脑型毛霉菌病*（23）、播散性鸟结核分枝杆菌群感染*（9）、协同感染*（4）、变应性支气管肺曲霉病*（32）、鸟结核分枝杆菌复合感染*（88）、脓肿分枝杆菌感染*（24）、皮肤毛霉菌病*（6） 各类检查 FEV1/FVC 比率异常*（8）、肺功能检查异常*（118）、右室收缩压*（3）、胸部 X 线检查异常*（140）、肺总容量升高*（8）、食管胃十二指肠镜检查*（9） 血液及淋巴系统疾病 婴儿急性出血性水肿*（5）、巴贝西虫病*（17）、色素性肾病*（6）、肠系膜上动脉夹层*（6） 呼吸系统、胸及纵隔疾病 先天性裂孔疝*（10）、支气管良性肿瘤*（6）、支气管吻合处并发症*（7）、肺弥散功能疾病*（21）、上呼吸道坏死*（4）、嗜血杆菌性支气管炎*（6）、通气/血流比例失调*（22）、中叶综合征*（4）、哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠综合征*（15）、支气管软化*（7）、支气管扩张症感染性加重*（8） 生殖系统及乳腺疾病 嗅觉生殖器发育不全*（3）、阴道狭窄*（3） 妊娠期、产褥期及围产期状况 不全流产*（132）、胎盘坏死*（4） 全身性疾病及给药部位各种反应 皮肤黏膜疾病*（17）、开裂*（7） 免疫系统疾病 胸膜实质纤维弹性组织增生*（6） 良性、恶性及性质不明的肿瘤
（包括囊状和息肉状）鼻窦息肉变性*（7）、鼻息肉*（152） 各种先天性家族性遗传性疾病 NPM1 基因突变*（11）、异源嵌合型*（11）、先天性软垂疣*（6） 各种肌肉骨骼及结缔组织疾病 椎体终板炎症*（4） 各类神经系统疾病 肌阵挛性肌张力障碍*（12） 肾脏及泌尿系统疾病 输尿管穿孔*（4） *表示该不良反应为在药品说明书上未标注的不良反应。 3. 讨论
3.1 阿奇霉素ADE报告在性别、年龄、地区间差异较大
本研究纳入的ADE报告中包括女性患者
18055 例（58.17%），男性患者10269 例（33.08%），男女比例约为1∶1.76，这表明性别与ADE的发生率之间存在着显著关联，女性发生不良反应的情况远高于男性，这可能与妇女妊娠有关。而ADE报告中涉及患者中老年人占比高可能与中老年人本身既往疾病较多、免疫力较为低下有关。另外，虽然0～18岁未成年人患者ADE报告比例只有6.29%，但相关研究表明，青少年和高龄人群均属于阿奇霉素诱发心血管不良反应的高危人群[16−17]，因此需要对其用药时应予以重视。此外，阿奇霉素一般会和中药联合运用，这会导致患儿出现不良反应的概率明显增加，所以在对其联合用药干预时，需重视用药监护工作[18]。ADE报告例数最多的国家是美国（13632 份报告），占比高达43.92%，这可能与FAERS数据库作为美国官方数据库，美国的医疗体系对不良事件上报的要求更高，上报数量更多有关。严重ADE（死亡、残疾、危及生命、住院治疗）占比约63.20%，可见阿奇霉素产生的ADE后果一般较严重，需针对患者服药后状况加以密切监护。3.2 报告警戒信号与药物说明书有差异
为避免单一的信号检测方法影响结果的准确及可信度，本研究同时采用了比例失衡法中的报告比值法（ROR）和贝叶斯置信区间神经传播网络法（BCPNN）进行检测。ROR法能消除大量偏倚，灵敏度较高，但特异性比较低，结果容易出现假阳性；BCPNN法结果更稳定、特异性更高，将两种方法结合使用还可降低单一算法所致的结果偏倚[19]。阿奇霉素说明书中提及的不良反应主要集中于服药后会出现药物过敏反应，包括血管神经性水肿、过敏性休克反应和皮肤等；另外也会出现相关的肝毒性症状，如肝功能异常、肝炎、胆汁淤积性黄疸等，同时提示孕产妇应慎用。本研究中挖掘到的药品说明书以外的ADE信号主要累及呼吸系统如出现哮喘、哮鸣，上呼吸道感染、COPD等，提示临床上使用阿奇霉素时应加强对呼吸系统的监测与关注；此外，针对报告数较多或者信号强度较大的不良事件，如不全流产、分娩提前等，因其警戒值较高，建议考虑将孕产妇患者纳入禁用人群。
3.3 研究局限性
本研究数据样本较大，提高了研究的准确性，但是仍存在一些不足与缺陷。本研究中ADE报告筛选是基于阿奇霉素药物的，但并未考虑不同品牌药品中所含的配方差异可能会导致的药物不良反应，另外由于FARES数据库在世界各地的使用率不同会影响不同地区报告数量，本研究数据大部分来源于欧美地区，亚洲样本数较少，因此不同地区人群不良事件的实际发生情况可能存在一定程度的偏差，无法确保相关不良事件在各地具有不同的发生率[20]，需结合亚洲人群较多的ADE数据库，才能得出更全面的结论。此外，FAERS数据库是自发呈报式数据库，各单位上报过程中可能会出现漏报、错报和重复上报等问题，以及患者的基础病进展、合并用药等，都会使结果出现一定程度的偏倚[21]，如欲确定因果关系，需要结合临床数据进一步验证。
本研究基于真实世界数据，即FAERS数据库中的ADE报告对阿奇霉素历年来出现的不良事件进行了较为全面的研究分析。发现ADE信号中药物性超敏反应、上呼吸道感染、咳痰、慢性阻塞性肺疾病、胃食管反流病、全血细胞计数异常与说明书上提及的阿奇霉素的不良反应基本一致，而体现在慢性肾脏疾病、急性肾损伤、不全流产等，是相较于药物说明书上未记录的新信号，可为阿奇霉素的临床使用提供一定参考，以减少临床用药不良事件的发生。
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图 1 Nrf2的沉默效果验证（$\bar x \pm s $，n = 3）
A：各组Nrf2的RNA的表达；B：细胞质中各组Nrf2的蛋白表达；C：细胞核中各组Nrf2的蛋白表达。**P < 0.01。
Figure 1. Experimental validation of the silencing effect of Nrf2 （$\bar x \pm s $，n = 3）
图 2 CCK-8 检测各细胞活力比较（$ \bar x \pm s$%，n = 3）
**P < 0.01；+：阳性标本处理；-：阴性标本处理。
Figure 2. Comparison of cell viability among different groups detected by CCK-8（$\bar x \pm s $%，n = 3）
图 3 流式检测各组细胞活性氧（$\bar x \pm s$，n = 3）
*P < 0.05；**P < 0.01；+：阳性标本处理；-：阴性标本处理。
Figure 3. Flow cytometry detection of reactive oxygen species in each group of cells（$\bar x \pm s $，n = 3）
图 4 各组COL-Ⅱ相对表达量（$ \bar x \pm s$，n = 3）
**P < 0.01；+：阳性标本处理；-：阴性标本处理。
Figure 4. Relative expression levels of COL-II in each group（$\bar x \pm s$，n = 3）
图 5 RT-qPCR检测各组Nrf2、MMP-3、PINK1、Parkin、p62、p38 MAPK的相对表达量（$ \bar x \pm s$，n = 3）
A：各组MMP3表达；B：各组p62表达；C：各组p38MAPK表达；D：各组Nrf2表达E：各组PINK1表达；F：各组Parkin表达；*P < 0.05，**P < 0.01；+：阳性标本处理；-：阴性标本处理。
Figure 5. RT-qPCR detection of relative expression levels of Nrf2，MMP-3，PINK1，Parkin，p62，p38 MAPK in each group（$ \bar x \pm s$，n = 3）
图 6 miR-153-3p与 Nrf2间存在结合位点和结合关系（$\bar x \pm s $，n = 3）
A：根据miR-153-3p与 Nrf2的结合位点的预测结果构建的突变系列；B：双荧光素酶报告分析检测各组荧光素酶相对活性。**P < 0.01。
Figure 6. Binding sites and relationships between miR-153-3p and Nrf2 （$\bar x \pm s $，n = 3）
表 1 引物序列
Table 1. primer sequence
基因 引物序列 产物长度/bp 序列号 PINK1 F TTGCCCCTAACACGAGGAAC 95 NM_032409.3 R ACGTGCTGACCCATGTTGAT Parkin F GACAGCAGGAAGGACTCACC 123 XM_011535863.1 R GCTGCACTGTACCCTGAGTT P62 F ACTGCTCCAACCTCATCTGC 96 NM_001193357.2 Homo R TAAGCTGAAGCCCTGTGTCC p38 MAPK F ATGCGTCTGACAGGAACACC 108 NM_001315.3 Homo R CGCAAAGTTCATCTTCGGCA Nrf2 F GCCAACTACTCCCAGGTTGC 122 NM_006164.5 Homo R AACGTAGCCGAAGAAACCTCA MMP-3 F AGCCAACTGTGATCCTGCTT 102 NM_002422.5 Homo R TTCCTGAGGGATTTGCGCC Col-Ⅱ F AGGACTCTGCACTGAATGGC 106 NM_001844.5 Homo R TCTGCCCAGTTCAGGTCTCT β-actin F GTCATTCCAAATATGAGATGCGT 121 NM_001101.5 R GCTATCACCTCCCCTGTGTG 
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表 2 流式检测各组线粒体膜电位（$\bar x \pm s$，n = 3）
Table 2. Flow cytometry detection of mitochondrial membrane potential in each group（$\bar x \pm s$，n = 3）
分组 线粒体膜电位下降比例 F P ①对照组 16.13 ± 1.65▲ 39.713 0.00 ②H2O2组 7.84 ± 0.95 ③H2O2 + miR-153-3p inhibitor-NC + si-Nrf2-NC 8.63 ± 0.79∗ ④H2O2 + miR-153-3p inhibitor + si-Nrf2-NC 15.03 ± 1.72▲ ⑤H2O2 + miR-153-3p inhibitor + siRNA-Nrf2 6.03 ± 0.76∗ 组③、⑤组间比较，*P < 0.05；组①、④分别与组②、③、⑤比较，▲P < 0.05。
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