多重耐药鲍曼不动杆菌的出现和持续存在是全球医疗机构共同面临的挑战，其严重感染所致的死亡率极高，尤其是ICU患者^[1]。2024年世界卫生组织（World health organization，WHO）发布最新细菌优先病原体预警清单简称 “2024 WHO BPPL”，其中耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）被列为关键优先级，是全球5大病原体之一^[2]。

因此，本研究收集临床呼吸科肺部感染所分离的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，AB），探讨AB及多重耐药鲍曼不动杆菌（Multidrug-resistant acinetobacter baumannii，MDRAB）之间生物膜形成差异，以及由外排泵及生物膜基因调控参与的耐药性，为今后MDRAB耐药防治，新药物的开发提供科学依据。

1.   材料与方法

1.1   菌株来源

119株鲍曼不动杆菌均源自昆明医科大学附属延安医院2023年5月至2023年11月临床呼吸科肺部感染患者送检的呼吸道培养标本，同病人同部位来源的样本视为重复样本，予以剔除，所有菌株均经MALDI-TOF-MS鉴定为鲍曼不动杆菌菌株。

1.2   仪器与试剂

二氧化碳培养箱、布鲁克质谱仪、VITEK2-Compact仪器、药敏实验试剂耗材，公司引物、Marker、琼脂糖、TAE缓冲液，恒温孵育器、离心机、核酸扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统。

1.3   细菌鉴定及药敏试验

参照国家行业标准规范操作。采用VITEK2-Compact仪器进行药敏试验。其中，氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、米诺环素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦的药敏试验采用纸片扩散法（Kirby-Bauer，K-B），其余均采用微量肉汤稀释法检测最低抑菌浓度法（Minimal inhibitory concentration，MIC）。结果判定参照美国临床与实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）当年的标准^[3]。3株质控菌株包括：大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、金黄色葡萄球菌 （ATCC25923）购自卫生部临检中心，MDRAB纳入标准即按定义标准纳入，收集菌株于-70 ℃温度条件下保存待用。

1.4   外排泵及生物膜基因检测

1.4.1   通过煮沸法，获得PCR模板

首先，把MDRAB复苏转种血平板，经过18-24 h的培养。接着，从中选择单个菌株充分混匀到300 μL的蒸馏水中。最后，通过煮沸法离心后而获得上清液作为DNA模板，并在-20 ℃的冰箱中加以储存。

1.4.2   PCR扩增反应体系

总体积50 μL，包括MasterMix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL，蒸馏水21 μL。引物序列及产物长度见表1、表2，参照文献^[4−6]，由北京博迈德基因技术有限公司合成。反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s ，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

表  1  鲍曼不动杆菌生物膜相关基因引物列表

Table  1.  List of gene primers associated with acinetobacter baumannii biofilm

基因名称	引物	核酸系列（5'→3'）	产物长度（bp）
Bap	F	GAGGGAACTTCTGCAAAACTTTC	108
	R	CAGACGTATGACTGCATTGGT
ompA	F	GAGTCGTATTGCACTTGCTAC	594
	R	GCAGGCTTCAAGTGACCACC
csuA	F	GAGGGAAGATGATATTCAATCGTG	517
	R	CCCTTAGATATACGACTACCATCAT
csuB	F	GCAGCAGATCCTCAGCTCAATTCA	354
	R	GTTTGTAGGTGTTGTAGCAGGC
csuC	F	ATACGGGTAAGACCGATGC	466
	R	GTTTTCAGTGCCGAAAGACG
csuD	F	GCTGATTTTATTGTCGGGTGGA	464
	R	GCCCTATACCAGACTGAGCGAC
csuE	F	ACCAATGCTCAGACCGGAG	751
	R	CTTGTACCGTGACCGTATCTTG
abaI	F	CCGCTACAGGGTATTTGTTGAA	428
	R	CACGATGGGCACGAAAACC
bfmR	F	GAAGTTGGTGTAGAAACCGATG	557
	R	GGATTTTCAGGATCATCGCC
bfmS	F	CATTAGTGAAGGAGTCGCTCG	990
	R	GGTGTACCCTGCTCTAGTTTT

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表  2  鲍曼不动杆菌外排泵相关基因引物列表

Table  2.  List of gene primers associated with efflux pump of acinetobacter baumannii

引物名称	引物	序列（5'→3'）	产物长度（bp）
adeB	F	TTAACGATAGCGTTGTAACC	541
	R	TGAGCAGACAATGGAATAGT
adeR	F	ACTACGATATTGGCGACATT	447
	R	GCGTCAGATTAAGCAAGATT
adeS	F	TTGGTTAGCCACTGTTATCT	544
	R	AGTGGACGTTAGGTCAAGTT
adeJ	F	ATTGCACCACCAACCGTAAC	453
	R	TAGCTGGATCAAGCCAGATA
abeM	F	GTAGGTGTAGGCTTATGGA	303
	R	GTACCGAAGTGACTGAAAT
adeG	F	TTCATCTAGCCAAGCAGAAG	468
	R	GTGTAGTGCCACTGGTTACT
16S rRNA	F	GGAGGAAGGTGGGGATGACG	241
	R	ATGGTGTGACGGGCGGTGTG

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1.4.3   PCR产物分析

将其置入2%琼脂糖凝胶中，110 V电泳30 min后，置入凝胶成像系统扫描成像。若结果显示1个与预期产物大小相同的条带，则将其送至北京博迈德基因技术有限公司，以便进一步的测序分析，最终的测序数据将在NCBI的Blast上对比验证。

1.5   生物膜形成试验

1.5.1   生物膜试验

为了证实鲍曼不动杆菌生物膜形成能力，采用LB肉汤作为培养基，并将其置于24孔细胞培养皿内培养24 h，随后，我们使用1%的结晶紫来检测该菌的生物膜的形成能力，因为其表面覆盖的是1层带有正电荷的染料，可以根据着色情况以此判断能力强弱。

1.5.2   结果判读

以肉汤对照孔为阴性对照，先肉眼观察爬片上结晶紫染色情况，然后显微镜观察生物膜的形成情况，以显微镜下无生物膜形成者判为阴性，有生物膜形成者判为阳性。

1.6   统计学处理

使用WHONET 5.6软件进行结果处理；采用SPSS 24.0统计分析数据，计数资料组间比较采用Fisher确切概率法，P < 0.05 表示差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   耐药情况

本院分离培养的119株AB对氨苄西林-舒巴坦、头孢吡肟、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星耐药率偏高，均在60%以上，对四环素、替加环素和多粘菌素敏感性较好，见表3。

表  3  119株AB对临床常用抗菌药物的耐药情况

Table  3.  Resistance of 119 strains of AB to commonly used antimicrobial drugs in clinical practice

药品名称	耐药菌株数	百分比%
氨苄西林/舒巴坦	76	63.9
米诺环素	9	7.6
阿米卡星	57	47.9
哌拉西林	93	78.2
哌拉西林/他唑巴坦	86	72.3
头孢曲松	77	64.7
头孢吡肟	76	63.9
亚胺培南	75	63.0
庆大霉素	51	42.9
妥布霉素	46	38.7
环丙沙星	78	65.5
左氧氟沙星	72	60.5
四环素	33	27.7
头孢他啶	77	64.7
美洛培南	80	67.2
头孢哌酮/舒巴坦	72	60.5
替加环素	2	1.7
多粘菌素B	1	0.8

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74株MDR菌株对哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢曲松、头孢吡肟、环丙沙星、美罗培南的耐药率为100%，对氨苄西林/舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明的耐药率在50%以上，MDR菌株与非MDR菌株对临床常用抗菌药物的耐药情况，见图1。

图  1  MDR-AB与非MDR-AB对临床常用抗菌药物耐药情况

Figure  1.  Resistance of MDR-AB and non-MDR-AB to commonly used antimicrobial drugs in clinical practice

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2.2   鲍曼不动杆菌生物膜及外排泵相关基因检测结果

2.2.1   鲍曼不动杆菌生物膜相关基因结果

生物膜相关基因PCR扩增后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳，119株鲍曼不动杆菌有1株未检出生物膜基因，生物膜相关基因bap、ompA、csuA、csuB、csuC、csuD、csuE、abaI、bfmS及bfmR的检出率分别为81.51%、84.87%、70.59%、70.59%、90.76%、78.99%、68.07%、78.99%、87.39%、89.08%。bap、csuB、csuC、csuD基因在MDR组的携带情况明显高于非MDR组（P < 0.05），ompA、csuA、csuE、abaI、bfmS及bfmR基因在MDR与非MDR组检出率无显著性差异。见图2。

图  2  生物膜相关基因及部分外排泵基因PCR扩增电泳图

Figure  2.  PCR amplification electropherogram of biofilm-related genes and some efflux pump genes

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2.2.2   鲍曼不动杆菌外排泵相关基因

外排泵相关基因adeB、adeJ、adeS以及adeR 经PCR扩增后，扩增产物电泳结果，见图2，adeG及16s rRNA PCR扩增产物电泳结果，见图3。119株鲍曼不动杆菌有8株未检出任何外排泵相关基因，其中非MDR菌株5株，MDR菌株3株。119株AB菌株外排泵相关基因adeB、adeJ、adeG、adeS以及adeR的检出率分别为65.55%、67.23%、42.02%、57.98%和75.63%。所有菌株均未检出abeM基因，其中deB、adeJ、adeS以及adeR在MDR组的携带情况明显高于非MDR组（P < 0.05）。

图  3  外排泵adeG基因PCR扩增电泳图 和16s rRNA基因PCR扩增电泳图

Figure  3.  PCR amplification electropherogram of efflux pump adeG gene and 16s rRNA gene

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2.3   生物膜形成实验

在119株试验菌株中有114株生物膜形成能力试验阳性，阳性率95.80%；MDR菌株中有1株未形成生物膜，阳性率为98.65%（73/74）；非MDR菌株中有4株未形成生物膜，阳性率为91.11%（41/45）。MDR菌株和非MDR菌株在生物膜形成能力方面无显著性差异。

3.   讨论

3.1   鲍曼不动杆菌耐药形势及药物选择难题

随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用，越来越多的碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌在很多国家和地区呈现增加的趋势^[7]。据统计报道，全球感染鲍曼不动杆菌的人每年高达上百万以上^[8]，在美国以南的美洲地区感染率高达70%，相对于其他革兰氏阴性菌，鲍曼不动杆菌的多重耐药率超过常见的铜绿假单胞菌和肺炎克雷伯菌耐药率4倍，其感染的死亡率在ICU尤为显著较高，可达60%^[1]。CHINET 监测网数据报道：耐碳青霉烯类抗生素革兰阴性细菌检出率逐年增加，不动杆菌属的细菌耐药率及增长率排在第1位，临床分离出的鲍曼不动杆菌耐药现象日趋严重^[9]。本次研究分离的74株多MDR-AB中，耐药率偏高，多重耐药现象明显，从该研究结果来看，建议治疗鲍曼不动杆菌引起的感染不应常规使用第3、4代头孢菌素、碳青霉烯类、β-内酰胺酶抑制剂类及喹诺酮类药物，似乎敏感性较好的替加环素、米诺环素和多黏菌素可作为临床治疗MDR-AB感染性疾病的选择，然而在实际的临床治疗中，由于药物毒性、副作用及异质性耐药等问题，治疗疗效也不佳。

3.2   鲍曼不动杆菌生物膜基因携带与生物膜形成能力相关分析

鲍曼不动杆菌的长期感染和耐药性的重要因素之一是它在生物和非生物表面上定居和形成生物膜的能力^[10]。生物膜内的细菌细胞具有高度的协调性，并进行表型转换，以产生1个能抵抗不利外部环境的群落^[11-12]。笔者在对119株AB研究中显示：95.8%的AB菌株具有生物膜形成能力，AB生物膜形成能力高于蔺飞^[13]等的研究结果，而低于牛付轩^[14]的研究结果。本研究中生物膜相关基因以csuC检出率最高，为90.76%，csuE的检出率最低为68.07%，生物膜相关各基因中，部分基因的携带情况与蔺飞^[13]，牛付轩^[14]，谢思露^[15]的研究具有一定的相似性，同时也存在一定的差异，可能与所统计菌株的样本来源、地域差异性导致抗生素选择压力等因素有关。在对MDR-AB与非MDR-AB在生物膜基因携带情况的比较发现：bap、csuB、csuC、csuD在MDR菌株的携带情况明显高于非MDR菌株（P < 0.05），推测AB多重耐药与bap、csuB、csuC、csuD基因调控表达有关。经统计发现：相关基因组合csuA/B/C、csuA/B/C/D、csuA/B/C/D/E及bfmR+bfmS组合在MDR与非MDR菌株间差异间无统计学差异（P > 0.05）；而bap+abaI+ompA组合在MDR菌株的携带情况高于非MDR菌株（P < 0.05），这与不同生物膜相关基因所对应的功能作用相关，csu基因家族及bfmR/S是介导及调控AB生物膜形成前期菌毛的产生和粘附作用，参与的是生物膜形成早期细菌的定植和粘附；而bap+abaI+ompA基因与生物膜的形成、发展成熟及解聚再定植有关。当然，生物膜的形成过程极为复杂，生物膜形成受到多个基因的表达调控的影响，本课题研究未涉及的其余生物膜相关基因如：pgaA/B/C/D、gacS、pglC等，其在生物膜的形成以及对细菌的耐药性或许存在一定的影响。同时，生物膜相关基因的表达与否，表达量的多少也是影响生物膜形成的1个重要因素^[16]。

3.3   鲍曼不动杆菌外排泵介导耐药性分析

鲍曼不动杆菌由于体内外排泵的表达增强，因此可以对庆大霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、喹诺酮类等抗菌药物表现出多重耐药性^[17]。在本研究中，我们主要研究了外排泵RND家族的外排adeB、adeG及adeJ基因和调控基因adeR及adeS，以及MATE家族基因abeM在两组AB菌株中的携带情况，经统计分析发现，adeB、adeJ基因和adeR、adeS基因在MDR组的携带情况明显高于非MDR组，与周亚玲^[4]等的结论相一致；adeG基因在非MDR组检出情况高于MDR组。本研究的所有菌株均未检出abeM基因，与Wang L^[5]的研究相一致。研究结果表明，不同AB菌株常可携带多个外排泵基因，外排泵基因adeB+adeG的组合在MDR菌株组的携带情况明显高于非MDR菌株组，其余基因组合在两组间无显著性差异。同时，笔者也注意到，在MDR菌株中，有3株菌株未携带任何的外排泵相关基因，可能其对药物的外排作用主要由其他非RND家族外排泵所介导，亦或是多重耐药的原因是外排泵以外的其他耐药机制作用引起，具体原因尚需进一步实验进行验证。

3.4   研究的局限性

本文通过对生物膜形成能力、外排泵和生物膜相关基因携带情况在MDR和非MDR菌株间的差异性比较，可以推测外排泵对AB菌株多重耐药性影响大于菌株生物膜形成作用，预示着主动外排系统过表达是导致鲍曼不动杆菌多重耐药性的重要因素之一。但本研究缺乏对不同感染部位、不同治疗方案来源的菌株进行深入分析其耐药相关性，因此在临床治疗策略的应用上存在局限性，本研究将在后续工作中完善入组条件，尽可能排除干扰因素对结果所带来的差异性影响，从而更加明确阐明鲍曼不动杆菌在不同生存环境所导致的耐药性问题，为临床治疗提供精准的治疗依据。