我国不同地区报道的成人腰痛患病率为7.21%～39.0%，年患病率为 20.88%～29.88%，已经成为我国一个非常严峻的公共卫生问题^[1]，而腰椎间盘退变（lumbar disc degeneration，LDD）是导致下腰痛的重要因素^[2]。椎间盘是人体最大的乏血管神经的组织，当椎间盘发生退变 时血管神经向椎间盘内延伸，极易诱发椎间盘退变，进而出 现腰痛，但其具体的发病机制有待深入探讨。髓核（nucleus pulposus，NP）细胞是椎间盘中主要的细胞，其异常增殖或过度凋亡是LDD中最明显的细胞和生化变化之一。而H₂O₂和miR-153-3p可能是调节这一过程的重要因素之一。本研究旨在阐明H₂O₂对于腰椎髓核细胞的影响及初步探讨miR-153-3p对于腰退行性病变的调节机制。

1.   材料与方法

1.1   标本来源

本实验研究标本采用从Sciencell公司购买正常腰椎髓核细胞：Human Nucleus Pulposus Cells， Catalog #4800。

1.2   实验分组

实验分为：（1）对照组；（2）H₂O₂组；（3）miR-153-3p inhibitor NC（以下简称inhibitor-NC组）；（4）miR-153-3p inhibitor（以下简称inhibitor组）。总例数n = 48，每组例数n = 12。

1.3   标本处理方法

对照组：采用髓核细胞培养基（DMEM细胞培养液、品牌：GIBCO）体外培养；H₂O₂组：髓核细胞培养基体进行体外培养，并予200 μmol/L H₂O₂处理6 h；inhibitor组：加入miR-153-3p inhibitor，是一段序列跟miR-153-3p 序列互补的抑制序列miRNA；inhibitor-NC组：miR-153-3p inhibitor NC是一段无功能序列的miRNA，起对照作用。实验时，按照要求将加入对应分组的RNA。

1.4   检测方法

1.4.1   RT-qPCR检测

miR-153-3P、COL-Ⅱ、MMP3、Nrf2 总ＲNA提取后，反转录cDNA，根据试剂盒说明书进行9PCR。反应条件95℃，30 s预变性，95℃ 5 s，60℃ 35 s共40个循环。相对表达量用2^-△△Ct法计算，引物序列见表1。

表  1  RT-qPCR 引物序列

Table  1.  Rt-qPCR primer sequence

引物名称	引物序列	产物长度（bp）	数据库	种属	厂家	熔解曲线（℃）
miR-153-3p-F	TTGCATAGTCACAAAAGT	70	MIMAT0000439	人	生工	79
miR-153-3p-R	CAGTGCGTGTCGTGGAGT
U6-F	CTCGCTTCGGCAGCACA	80	NR_004394.1	人	生工	82.5
U6-R	AACGCTTCACGAATTTGCGT
Nrf2-F	GCCAACTACTCCCAGGTTGC	122	NM_006164.5 Homo	人	生工	85.5
Nrf2-R	AACGTAGCCGAAGAAACCTCA
ACTB-F	GTCATTCCAAATATGAGATGCGT	121	NM_001101.5	人	生工	85.5
ACTB-R	GCTATCACCTCCCCTGTGTG

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1.4.2   WesternBlot检测Nrf2表达

加入裂解液提取总蛋白，蛋白浓度用BCA法测定。随后进行电泳，转膜，封闭1.5 h，4 ℃加封闭液稀释的一抗过夜后，TBST洗膜，加封闭液稀释的二抗37 ℃孵育90 min，加入显影液显影，利用蛋白条带的吸光度计算蛋白表达量。

1.5   检测指标

实验分两部分进行：（1）采用CCK8检测对照组及H₂O₂组细胞活力，流式检测两组细胞活性氧及线粒体膜电位，另外采用qPCR检测上述两组的基质金属蛋白酶3（MMP3）、Nrf2、miR-153-3p、Ⅱ型胶原（COL-Ⅱ）表达含量。（2）采用qPCR检测对照组、miR-153-3p inhibitor-NC组及miR-153-3p inhibitor组的Nrf2、miR-153-3p表达含量；采用Westernblot检测对照组、miR-153-3p inhibitor-NC组及miR-153-3p inhibitor组的Nrf2表达含量。

1.6   统计学处理

实验所得数据采用均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，检验方法：计量资料两样本比较采用独立样本t检验；多样本组间比较采用单因素方差分析后多重比较，检验水准取双侧α = 0.05，P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   H₂O₂对髓核细胞活性影响

用CCK8检测对照组、H₂O₂组的细胞活力进行检测，结果提示经H₂O₂处理的腰椎髓核细胞活力较对照组明显下降，差异具有统计学意义（P < 0.05），见表2。

表  2  CCK8检测对照组、H₂O₂组细胞活力比较[（$\bar x \pm s$）%]

Table  2.  Comparison of cell viability between CCK8 control group and H₂O₂ group [（$\bar x \pm s $）%]

组别	细胞活力	t	P
对照组	1.00 ± 0.10	8.592	0.000#
H2O2组	0.55 ± 0.08

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2.2   用流式细胞检测对照组、H₂O₂组的细胞活性氧、线粒体膜电位

结果提示经200 μmol/L H₂O₂处理的腰椎髓核细胞活性氧含量明显增加（P < 0.05，差异具有统计学意义）；H₂O₂组细胞线粒体膜电位较对照组明显降低（P < 0.05，差异具有统计学意义），提示H₂O₂处理的腰椎髓核细胞线粒体膜电位降低，见表3，表4。

表  3  流式检测对照组、H₂O₂组细胞活性氧（$\bar x \pm s $）

Table  3.  Flow detection of reactive oxygen species in control group and H₂O₂ group （$\bar x \pm s $）

组别		平均荧光强度值	t	P
对照组		32423.33 ± 4157.62	−7.555	0.000#
H2O2组		62127.83 ± 8686.98*

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表  4  流式检测对照组、H₂O₂组细胞线粒体膜电位（$\bar x \pm s $）

Table  4.  Flow cytometry detection of mitochondrial membrane potential in control group and H₂O₂ group （$\bar x \pm s $）

组别	线粒体膜电位下降比例	t	P
对照组	16.43 ± 1.30	11.736	0.000*
H2O2组	7.98 ± 1.19
注：经正态性检验，两样本符合正态分布，采用两独立样本的t检验。*P < 0.05。

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2.3   采用qPCR检测对照组、H₂O₂组的miR-153-3p、COL-Ⅱ、MMP3、Nrf2表达含量

结果提示对照组、H₂O₂组Nrf2表达量无明显差异（P > 0.05），H₂O₂组的miR-153-3p、MMP3表达量较对照组明显减少，而其COL-Ⅱ表达量较对照组明显减少（P < 0.05，差异具有统计学意义），见表5。

表  5  qPCR检测对照组、H₂O₂组相关miRNA或mRNA相对表达量（$ \bar x \pm s $）

Table  5.  Relative expression levels of miRNA or mRNA in control group and H₂O₂ group detected by qPCR （$\bar x \pm s $）

组别	miR-153-3P	COL-Ⅱ	MMP3	Nrf2
对照组	1.01 ± 0.18	1.01 ± 0.16	1.01 ± 0.16	1.01 ± 0.15
H2O2组	2.29 ± 0.44*	0.52 ± 0.16*	2.52 ± 0.75*	0.98 ± 0.13
与对照组相比，*P < 0.05。

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2.4   采用qPCR检测对照组、miR-153-3p inhibitor-NC组及miR-153-3p inhibitor组的Nrf2、miR-153-3p相对表达量

结果提示：与对照组、inhibitor-NC组相比，inhibitor组的miR-153-3p表达量降低、Nrf2表达量增高（P < 0.05，差异具有统计学意义）；而inhibitor-NC组与对照组的Nrf2、 miR-153-3p表达量无明显差异（P > 0.05），见表6，图1。

表  6  qPCR检测3组的Nrf2、miR-153-3p相对表达量（$\bar x \pm s $）

Table  6.  Relative expression levels of Nrf2 and miR-153-3p in the three groups detected by QPCR （$\bar x \pm s $）

分组	miR-153-3p	NRF2
对照组	1.01 ± 0.18	1.01 ± 0.18
miR-153-3p inhibitor-NC组	1.19 ± 0.22*	0.98 ± 0.18
miR-153-3p inhibitor组	0.37 ± 0.07*	2.65 ± 0.41*
*P < 0.05。

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图  1  qPCR检测3组miR-153-3p相对表达量图

与inhibitor-NC组相比，^**P < 0.01。

Figure  1.  Relative expression of miR-153-3p in the three groups detected by qPCR

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2.5   采用Westernblot检测对照组、inhibitor-NC组及nhibitor组的Nrf2表达含量

结果提示，与对照组、inhibitor-NC组相比，inhibitor组胞质及胞核中Nrf2表达量增高（P < 0.05，差异具有统计学意义），而inhibitor-NC组胞质及胞核中Nrf2表达量与对照组无明显差异（P > 0.05），见表7。

表  7  Westernblot检测3组的Nrf2相对表达量（$\bar x \pm s $）

Table  7.  Relative expression of Nrf2 in the three groups detected by Westernblot （$\bar x \pm s $）

分组	胞质	胞核
对照组	1.00 ± 0.17	1.00 ± 0.14
miR-153-3p inhibitor-NC组	1.10 ± 0.13	0.95 ± 0.15
miR-153-3p inhibitor组	1.47 ± 0.23*	2.33 ± 0.41*
与对照组，inhibitor-NC组相比，*P < 0.05。

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inhibitor-NC组胞质及胞核中的Nrf2表达量与对照组比较，P > 0.05，差异无统计学意义，见图2。

图  2  Westernblot检测3组的Nrf2相对表达量

^*P < 0.05。

Figure  2.  Relative expression levels of Nrf2 detected by Western blot in the three groups.

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3.   讨论

3.1   NPCs退变和ECM代谢失衡是LDD的主要病理特征

椎间盘主要由外周的纤维环、中央的髓核和上下终板组成。髓核和纤维环的细胞数量较少，但细胞外基质（ECM）丰富，约占整体的99%，后者主要由胶原（Ⅰ、Ⅱ型）和蛋白聚糖组成。髓核细胞（NPCs）可产生蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和其他ECM因子，有利于维持椎间盘完整性。LDD是一个复杂的过程，典型特征是ECM成分的丢失。LDD的早期退变出现在NPCs中，表现为水和蛋白聚糖的丢失，NPCs功能退化，合成分泌Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的能力减弱，ECM合成与分解代谢失衡，使椎间盘结构与成分发生变化，导致椎间盘功能减弱或丧失^[3]，引起神经痛甚至功能障碍。

在正常椎间盘中，ECM合成和降解处于动态平衡状态，其代谢依赖于基质金属蛋白酶（MMPs）、蛋白聚糖酶与基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）之间的平衡调节^[4]。MMPs是一类蛋白水解酶，可降解除多糖外的几乎所有ECM成分。蛋白聚糖酶是解聚素样金属蛋白酶家族的重要成员（ADAMTSs），主要降解蛋白聚糖。MMPs和ADAMTSs的活性可被内源性特异性的TIMPs所抑制。研究发现，在不同退变程度的人髓核组织样本中，MMPs和ADAMTSs表达明显升高，TIMPs表达与椎间盘退变程度呈负相关^[5]，因而会导致ECM成分降解增强，引起椎间盘结构和成分的改变，最终导致LDD。故MMPs、ADAMTSs与TIMPs之间的失衡在LDD的发病机制中发挥重要作用。

3.2   氧化应激通过激活多种通路影响NPCs功能以及ECM代谢，进而介导LDD

LDD病因复杂，越来越多的证据表明年龄、性别、环境、行为影响、氧化应激、炎症和遗传与LDD风险相关^[6]。其中，氧化应激能够通过加速椎间盘细胞的衰老、凋亡，调节细胞自噬以及ECM的合成与降解等多种途径介导椎间盘的退变，被认为是引起LDD的主要因素之一。活性氧簇（ROS）是细胞氧化代谢过程中的必然产物，广泛参与信号转导，代谢调节、程序性细胞死亡，衰老和椎间盘的表型转换等^[7]。当各种原因造成机体内ROS产生增多或机体对抗ROS能力下降时，机体处于氧化应激状态，此时ROS可通过细胞膜直接造成DNA、蛋白质、脂质的氧化损伤，从而引起NPCs功能损伤。在本实验中，H₂O₂组中腰椎髓核细胞活性氧含量增加、MMP3表达增加、Col Ⅱ含量下降，可以说明氧化应激可以影响NPCs功能以及ECM代谢，进而介导LDD。而这一进程可能与ROS可激活p38MAPK、Wnt/β-catenin等多种可引起炎症反应的信号通路有关^[8-9]。

3.3   线粒体自噬清除受损线粒体，减少ROS积聚，miR153/Nrf2/PINK1通路在其中发挥重要作用

在本实验中，H₂O₂处理的腰椎髓核细胞线粒体膜电位下降，说明H₂O₂诱导的NPCs衰老和凋亡与线粒体功能障碍有关。线粒体是产生ROS的能量工厂，线粒体自噬是神经退行性疾病中重要的细胞抗氧化途径，通过自噬途径对受损线粒体的选择性降解，在氧化应激过程中改善线粒体功能障碍，维持线粒体质量控制。大量研究表明，线粒体自噬可以保护NPCs免受线粒体途径诱导的氧化应激、衰老、细胞凋亡^[10-12]。

Nrf2作为一种可以调节含有细胞保护基因的抗氧化反应元件（ARE）的表达的转录因子，可进入细胞核并与包含靶基因的ARE序列结合，可激活靶基因的转录，参与氧化应激和ROS代谢过程。最近研究证实，在神经元中，Nrf2通过激活PINK1启动子的ARE序列，进而上调PINK1，PINK1通过清除受损的线粒体和减少ROS等多种机制参与线粒体稳态的维持，使细胞在细胞存活方面具有优势^[13-14]。此外，通过Nrf2/PINK1途径可调节和减弱管状细胞的氧化应激损伤和凋亡以维持线粒体质量，由此激活PINK1/Parkin诱导的线粒体自噬，影响下游Drp1和Mfn2表达量，最终可改善ROS的生成。

microRNA（miRNAs）是一类非编码小RNA，参与细胞增殖、ECM代谢、自噬、炎症反应、氧化应激、凋亡、线粒体功能调节等多种细胞活动，介导多种生理和病理反应。其中，miR-153被认为是一种神经富集miRNAs，在中枢神经系统的发育和功能以及神经退行性疾病的发病机制中均发挥重要作用。研究发现，miR-153靶向Nrf2 3’UTR，上调miR-153表达可影响Nrf2及其活化功能，进而削弱了神经元的抗氧化防御，使神经元死亡增多^[15]，还可升高ROS水平，通过ROS激活p38MAPK通路^[16]。大量证据已表明，miRNAs在退行性和正常NPCs之间存在差异表达，可通过调节MMPs的表达，进而影响ECM代谢，参与LDD进程^[17]。本实验结果已显示miR-153-3p可调控Nrf2表达，而调节miR-153-3p对于LDD进程的影响及相关机制，需要进一步地深入研究。

H₂O₂可引起腰椎髓核细胞活性氧含量增加、细胞活力下降、线粒体膜电位下降、MMP3增加、Col Ⅱ含量下降、miR-153-3p表达增加，说明了H₂O₂可引起腰椎髓核细胞线粒体功能障碍，导致ROS增加，引起腰椎髓核细胞外基质成分改变，从而加速腰椎间盘细胞的衰老、凋亡，促进LDD进程。Nrf2是PINK1基因转录调控因子，PINK1通过清除受损的线粒体和减少ROS等多种机制参与维持线粒体稳态，抑制miR-153-3p表达，可上调腰椎髓核细胞Nrf2表达水平，提示miR-153-3p参与存进LDD进程的过程可能与其调控Nrf2表达、调节线粒体自噬过程有关，但是相关机制有待进一步深入研究。