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利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法

李欢 徐秋月 王云娟 苏洋 唐睿珠

李欢, 徐秋月, 王云娟, 苏洋, 唐睿珠. 利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法[J]. 昆明医科大学学报, 2021, 42(9): 25-31. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210904
引用本文: 李欢, 徐秋月, 王云娟, 苏洋, 唐睿珠. 利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法[J]. 昆明医科大学学报, 2021, 42(9): 25-31. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210904
Huan LI, Qiu-yue XU, Yun-juan WANG, Yang SU, Rui-zhu TANG. The Rapid Detection of Nucleic Acid in SARS-CoV-2 by Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification[J]. Journal of Kunming Medical University, 2021, 42(9): 25-31. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210904
Citation: Huan LI, Qiu-yue XU, Yun-juan WANG, Yang SU, Rui-zhu TANG. The Rapid Detection of Nucleic Acid in SARS-CoV-2 by Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification[J]. Journal of Kunming Medical University, 2021, 42(9): 25-31. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210904

利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210904
基金项目: 云南省教育厅科学研究基金资助项目(2021J0237)
详细信息
    作者简介:

    李欢(1989~),女,云南保山人,医学硕士,主管技师,主要从事检验医学工作

    通讯作者:

    唐睿珠,E-mail:867046569@qq.com

  • 中图分类号: R446.9

The Rapid Detection of Nucleic Acid in SARS-CoV-2 by Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification

  • 摘要:   目的  利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法。  方法  针对新型冠状病毒的特征核壳蛋白N基因和开放阅读框1ab(ORF1ab)基因序列保守区设计引物,获得了 RT-LAMP 检测体系,并评价该体系的特异性、最低检测限、抗干扰能力和最佳反应时间。  结果  经检测新型冠状病毒核酸标准物质,其结果与预期相符,证实了该检测体系的可行性。  结论  利用逆转录环介导恒温扩增技术快速检测新型冠状病毒核酸的反应体系特异性好、灵敏度高,适用于边境条件有限地区。
  • 图  1  特异性评价

    A:ORF1ab基因引物组的特异性评价;B:N基因引物组的特异性评价。图A以ORF1ab基因引物组为引物,加入不同物质为模板,进行RT-LAMP扩增的结果;图B以N基因引物组为引物,加入不同物质为模板,进行RT-LAMP扩增的结果。1:以新型冠状病毒标准物质为模板; 2:以甲型、乙型流感病毒质粒为模板; 3:以灭菌注射用水为模板; NC为阴性对照。

    Figure  1.  Evaluation of specificity

    图  2  ORF1ab基因的最低检测限评价

    A:1~10:10个复孔,加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为8.96×102 copies/μL;B:1~10:10个复孔,加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.60×103 copies/μL;C:1~10:10个复孔,加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.50×103 copies/μL;NC为阴性对照。

    Figure  2.  Evaluation of limit of detection of ORF1ab gene set

    图  3  N基因的最低检测限评价

    以N基因引物组为引物,加入不同浓度的新型冠状病毒标准物质为模板,进行RT-LAMP扩增的结果。A:1-10:10个复孔,加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为1.73×103 copies/uL;B:1-10:10个复孔,加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.87×103 copies/uL;C:1-10:10个复孔,加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.50×103 copies/uL;D:1-10:10个复孔,加入的新型冠状病毒标准物质浓度均为0.40×103 copies/uL;NC为阴性对照。

    Figure  3.  Evaluation of limit of detection of N gene set

    图  4  抗干扰能力评价

    A:ORF1ab基因引物组的抗干扰能力评价;B:N基因引物组的抗干扰能力评价。图A以ORF1ab基因引物组为引物,在阳性、阴性模板中加入不同的干扰物质,进行RT-LAMP扩增的结果;图B以N基因引物组为引物,在阳性、阴性模板中加入不同的干扰物质,进行RT-LAMP扩增的结果。1:以新型冠状病毒标准物质和新鲜血液的混合物为模板; 2:以新型冠状病毒标准物质和鼻分泌物的混合物为模板; 3:以新型冠状病毒标准物质和样本保存液的混合物为模板; 4:以灭菌注射用水和新鲜血液的混合物为模板; 5:以灭菌注射用水和鼻分泌物的混合物为模板; 6:以灭菌注射用水和样本保存液的混合物为模板; NC为阴性对照。

    Figure  4.  Evaluation of anti-interference ability

    图  5  最佳反应时间评价

    A:ORF1ab基因引物组的最佳反应时间评价;B:N基因引物组的最佳反应时间评价。

    Figure  5.  Evaluation of optimal reaction time

    表  1  RT-LAMP引物序列

    Table  1.   Primer sequences for RT-LAMP

    基因名称Primer名称序列(5′-3′)
    F3 caaacgtaacaccaaccgc
    B3 ggcgagccttggggata
    ORF1ab FIP cggcaacaggtaaactccaccacgcccacaggacgtcaag
    BIP taagtgtgcgcgcgactatgtcgccttccacgagg
    LF ggaagacttccgagcggt
    F3 tgcggaaccggtgagt
    B3 cacggtctacgagacctcc
    N FIP ggccgggcatagagtgggtcaccggaattgccgggaag
    BIP ccgcaagactgctagccgagcrccctatcaggcagtacca
    LB tagcgttgggttgcgaaag
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    表  2  RT-LAMP反应结果的判读

    Table  2.   Strategies for judging RT-LAMP results of SARS-COV-2

    试验结果结果判断
    ORF1ab基因、N基因均(+) SARS-CoV-2阳性
    ORF1ab基因、N基因均(−) SARS-CoV-2阴性
    仅有ORF1ab基因(+) 重复检测,若仍为(+),则判为SARS-CoV-2阳性。
    仅有N基因(+) 重复检测,若ORF1ab基因、N基因均(+),则判为SARS-CoV-2阳性。
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-07-27
  • 网络出版日期:  2021-09-09
  • 刊出日期:  2021-09-30

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