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基于网络药理学分析灯盏乙素治疗动脉粥样硬化的分子机制和体内验证

张莉 王雨婷 石佳宁 余丹 杨仁华 沈志强 龙江 陈鹏

廖周俊, 杨少华, 刘立鑫, 胡晟, 陈轶晖, 康强, 张小文. AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移的影响[J]. 昆明医科大学学报, 2022, 43(6): 1-6. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220611
引用本文: 张莉, 王雨婷, 石佳宁, 余丹, 杨仁华, 沈志强, 龙江, 陈鹏. 基于网络药理学分析灯盏乙素治疗动脉粥样硬化的分子机制和体内验证[J]. 昆明医科大学学报, 2022, 43(8): 17-27. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220804
Zhoujun LIAO, Shaohua YANG, Lixin LIU, Sheng HU, Yihui CHEN, Qiang KANG, Xiaowen ZHANG. Effect of AK4 on Proliferation and Migration of Intrahepatic Bile Duct Carcinoma Cell HUCCT1[J]. Journal of Kunming Medical University, 2022, 43(6): 1-6. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220611
Citation: Li ZHANG, Yuting WANG, Jianing SHI, Dan YU, Renhua YANG, Zhiqiang SHEN, Jiang LONG, Peng CHEN. Network Pharmacology-based Analysis of the Anti-atherosclerosis Mechanism of Scutellarin and Experimental Validation in Vivo[J]. Journal of Kunming Medical University, 2022, 43(8): 17-27. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220804

基于网络药理学分析灯盏乙素治疗动脉粥样硬化的分子机制和体内验证

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220804
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(81860641);云南省科技计划重点基金资助项目(202001AS070035);云南省科技厅-昆明医科大学联合专项重点基金资助项目(202201AY070001-001;202101AY070001-015)昆明医科大学博士研究生创新基金资助项目(2021D05)
详细信息
    作者简介:

    张莉(1984~),女,河南南阳人,在读博士研究生,主要从事天然药物药理学的研究工作

    通讯作者:

    龙江,E-mail:longjiang69@163.com

    陈鹏,E-mail:ynkmcp@gmail.com

  • 中图分类号: R966

Network Pharmacology-based Analysis of the Anti-atherosclerosis Mechanism of Scutellarin and Experimental Validation in Vivo

  • 摘要:   目的  基于网络药理学分析灯盏乙素(Scutellarin) 治疗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS) 潜在的分子生物学机制。  方法  通过PubChem数据库进行灯盏乙素潜在的靶点预测,运用Disgenet,CeneCards筛选与AS关联的靶基因,利用Cytoscape 3.9.0建立疾病-靶点-成份可视化网络,使用String构建蛋白互作网络图,利用David数据库进行GO及KECG的网络构建。另外,高脂喂养复制APOE-/-小鼠AS模型, 用不同浓度的灯盏乙素灌胃治疗,利用RT-PCR方法验证筛选所得核心通路的表达变化。  结果   (1)网络药理学预测结果:灯盏乙素治疗AS的核心靶点共有肿瘤坏死因子-α (TNF-α),AKT丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT serine/threonine kinase,MAPK),低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor),载脂蛋白E(apolipoprotein E,APOE)等共106个。灯盏乙素调控PI3K/AKT信号通路(hsa04151)、Ras信号通路(hsa04014)、MAPK信号通路(hsa04010)(P < 0.05)等涉及细胞的增殖,炎症反应,氧化应激,及细胞凋亡等生物学过程来治疗AS;(2) 体内实验验证的结果:和模型组相比,灯盏乙素组呈浓度依耐性地下调PI3K、AKT、mTOR和Bcl-2 的mRNA表达,上调Bax和Caspase-3的mRNA表达,( P < 0.05)。另外,和模型组相比,灯盏乙素则呈浓度依耐性地下调小鼠血清TNF-α和IL-1β的含量( P < 0.05)。  结论  经过网络药理学筛选和RT-PCR验证,灯盏乙素通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制APOE-/-小鼠AS模型炎症反应,促进细胞凋亡而治疗AS。
  • 肝内胆管癌是一种具有高度侵袭性的恶性肿瘤[1],预后差,近年来,其发病率逐年升高[2]。腺苷酸激酶4(Adenylate kinase4,AK4)是腺苷酸激酶家族的一员,其分子量为25kDa,别称为AK3L1。多项研究显示AK4促进恶性肿瘤的发生发展[3-5]。但其对肝内胆管癌的作用尚无报道。本实验通过小干扰RNA手段,就AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移能力的影响作出探究。

    本实验所用肝内胆管癌细胞HUCCT1购自上海誉驰生物科技有限公司,该细胞已通过中国科学院昆明动物研究所鉴定明确。该细胞作为肝内胆管癌细胞株之一,常用于肿瘤增殖、迁移的研究。

    本实验采用siRNA技术以沉默AK4。siRNA购自上海市吉玛基因生物技术有限公司,共计构建6条si-RNA序列,序列设计见表1。本次实验分组为空白对照组(CON)、阴性对照组(siRNA-NC)、阳性对照组(siRNA-GAPDH)、实验组1(siRNA-AK4-1),实验组2(siRNA-AK4-2),实验组3(siRNA-AK4-3)。转染试剂采用上海市吉玛基因生物技术有限公司GP-transfect-Mate。采用免疫印迹法(Western Blot,WB)对实验组1、实验组 实验组3进行si-RNA筛选,其中空白对照组不添加siRNA,阴性对照组基因序列与目的基因序列无同源性,阳性对照组基因序列与内参GAPDH同源。各组间其余实验操作步骤(转染方法、WB、EdU、细胞划痕实验)均一致。

    表  1  si-RNA序列
    Table  1.  Sequence of si-RNA built by siRNA technology
    组别序列Antisense
    Negative control 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′
    GAPDH Positive control 5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′ 5′-AACCAUGUAGUUGAGGUCATT-3′
    siRNA-AK4-1 5′-GCGGAAGGGUAUAUAACCUTT-3′ 5′-AGGUUAUAUACCCUUCCGCCT-3′
    siRNA-AK4-2 5′-CAGGCUAAGACAGUACAAATT-3′ 5′-UUUGUACUGUCUUAGCCUGTT-3′
    siRNA-AK4-3 5′-CACCUAUUCAGUCCAAAGATT-3′ 5′-UCUUUGGACUGAAUAGGUGTT-3′
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    转染前1 d将HUCCT1细胞接种至6孔板中,以次日细胞融合度达到60%~80%为宜,用无抗生素的完全培养基进行培养。转染:(1)转染试剂室温备用;(2)按照每孔200 µL无血清培养基(1640培养基)加5~8 µL转染试剂配置转染试剂混合物。静置5 min;(3)按照每孔200 µL无血清培养基(1640培养基)加150/pmol siRNA配置siRNA混合物。静置5 min;(4)将转染试剂混合物滴加到siRNA混合物中,混匀,静置20 min;(5)20 min后将混合液均匀加至6孔板各孔中;(6)各孔另外加入1 600 µL无抗生素完全培养基;(7)孔板放入细胞培养箱中培养48 h,使用免疫印迹检测转染效率。

    (1)裂解细胞:使用PMSF(品牌:Beyotime,货号:ST506-2 PMSF)与RIPA裂解液(强)品牌:Beyotime,货号:P0013B)按照200∶1配置细胞裂解液。于冰上充分裂解细胞;(2)测蛋白浓度:取裂解产物于4 ℃离心机12000 r/min,离心30 min。吸取86 µL上清液,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(品牌:Beyotime,货号:P0012 500次)测定蛋白浓度;(3)取80 µL上清液加20 µL SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(品牌:Beyotime,货号:P0015L)沸水加热15 min;(4)电泳:配置12%下层胶,5%上层胶,蛋白上样量为2.5 µg,上层胶60 V恒压电泳,下层胶100 V恒压电泳;(5)转膜:甲醇浸泡PVDF膜,胶、膜放置妥当后以300 mA恒流条件下湿转发转膜,时间为30 min;(6)封闭:PVDF膜置于5%脱脂牛奶中封闭,缓慢摇晃,室温封闭2 h;(7):孵育一抗:兔单克隆抗体[EPR7678] to AK3L1抗体,(1∶7000,品牌:Abcam,货号:ab131327)。一抗孵育过夜,4 ℃;(8):孵育二抗:山羊抗兔IgG(H+L)(品牌:Proteintech,货号:SA00001-2,1∶10000),室温孵育2 h;(9)显影:ECL化学发光液孵育1 min后,于成像仪中曝光显影。

    (1)转染细胞:6孔板培养细胞。免疫印迹实验已明确siRNA-AK4-3的沉默效果最好,故本次实验使用siRNA-NC及siRNA-AK4-3做细胞转染。分组亦同。转染完成24 h开始进行EdU实验。(2)工作液孵育:使用BeyoclickTM Edu-555配置2XEdU工作液后(品牌:Beyotime,货号:C0075s),与无抗生素完全培养基等体积加入六孔板中,孵育2 h。(3):固定、染色:每孔1 mL固定液固定15 min,洗涤后加入通透液孵育15 min,Click反应液孵育15 min,1X Hoechst 33342溶液孵育10 min。(4):荧光检测:洗涤液清洗后于倒置荧光显微镜观察。

    (1)转染细胞:6孔板培养细胞。本次实验分组为siRNA-NC及siRNA-AK4-3。转染完成24 h开始细胞划痕实验。(2)画线:使用直尺于6孔板背面作横行画线。(3)划痕:待细胞融合度为95%~100%时,使用200 µL枪头沿直尺作垂直于画线的划痕。(4)冲洗:使用PBS冲洗孔板3次,动作轻柔,吸净PBS后,加入无血清1640培养液。(5)拍照:每孔以“十”字交叉处上下为定点,于0 h,12 h,24 h,36 h拍照,对比不同时间下各组细胞迁移能力,并进行统计分析。

    数据分析使用GraphPad Prism 8及SPSS 26统计软件,计量资料采用($\bar x \pm s $),计数资料用t检验,3组及多组计量资料采用单因素方差分析。所有检验取两端。P < 0.05为差异有统计学意义。

    免疫印迹法检测各组后量化结果分别为:空白对照组(CON):(0.9±0.01,)阴性对照组(siRNA-NC):(0.92±0.01),阳性对照组(siRNA-GAPDH):(0.95±0.04),实验组1(siRNA-AK4-1):(0.74±0.08),实验组2(siRNA-AK4-2):(0.45±0.04),实验组3(siRNA-AK4-3):(0.24±0.02)。免疫印迹结果显示各组内参齐,沉默效果较好,其中阳性对照组对GAPDH的沉默效果显著。各siRNA组中siRNA-AK4-3对AK4的沉默效果最好,见图12。因此,后期实验使用siRNA-NC作为对照组,siRNA-AK4-3作为实验组。

    图  1  各组中AK4蛋白的Western Blot条带
    Figure  1.  Western blot bands of AK4 protein in each group
    图  2  各组细胞中AK4蛋白的相对表达量
      siRNA-GAPDH组为阳性对照,取GAPDH/AK4。各组分别与siRNA-NC组比较,除CON组无统计学差异其余各组均有统计学差异。**P < 0.01,***P < 0.005,****P < 0.001。
    Figure  2.  The relative expression level of AK4 protein in each group

    Edu实验结果显示:siRNA-NC组增殖细胞(15.9±4.4)/视野,细胞总数(110.9±22.4)/视野。siRNA-AK4-3组增殖细胞数目(12.8±5.0)/视野,细胞总数(116.7±22.1)/视野。两组增殖比率有差异,差异有统计学意义。siRNA-NC组增殖细胞多于siRNA-AK4-3组,AK4促进细胞增殖,见图34

    图  3  EdU检测siRNA-NC与siRNA-AK4-3细胞的增殖情况(×200)
    Figure  3.  The proliferation of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells was detected by EdU (×200)
    图  4  siRNA-NC组与siRNA-AK4-3的细胞增殖比率
    *P < 0.05。
    Figure  4.  The proliferation rate of siRNA-NC group and siRNA-AK4-3

    图3中EdU中增殖的HUCCT1细胞被标记为红色荧光,Hoechst 33342中蓝色荧光标记的为视野下所有活细胞,Merge图由EdU和Hoechst 33342图像合并后得到。

    划痕实验取划痕面积/视野总面积,各组面积比见表2,差异有统计学意义,见图56。siRNA-NC组细胞迁移面积较siRNA-AK4-3组更大,AK4促进细胞迁移。

    表  2  划痕面积比
    Table  2.  Scratch area ratio
    项目0 h12 h24 h36 h
    siRNA-NC 0.39 ± 0.01 0.26 ± 0.017 0.12 ± 0.017 0.08 ± 0.026
    siRNA-AK4-3 0.39 ± 0.005 0.33 ± 0.001 0.24 ± 0.024 0.24 ± 0.027
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    图  5  siRNA-NC与siRNA-AK4-3细胞划痕后面积变化,图中红色边缘为Image J软件勾勒
    Figure  5.  The area changes of siRNA-NC and siRNA-AK4-3 cells after scratches,and the red edge in the figure is outlined by Image J software
    图  6  siRNA-NC组与siRNA-AK4-3组细胞划痕后面积占视野总面积比的变化
    *P < 0.05,**P < 0.01。
    Figure  6.  In the siRNA-NC group and siRNA-AK4-3 group,ns represented no difference in the ratio of cell area to total field area after scratches

    肝内胆管癌的手术治疗是极其重要的,目前全球范围内术后其平均无瘤生存时间( DFS) 为12 ~ 36 个月[6-7],但胆管癌起病隐匿,多数患者在发现疾病时已属晚期[8],据报道,肝内胆管癌的根治切除率为30%~40% ,其他肝胆恶性肿瘤均比此数据高[19]。肝内胆管癌的辅助化疗(吉西他滨联合铂类)在一定程度上实现肿瘤将期,从而获得手术机会[10-12],但其中位生存期仍然不到1 a时间[13-15]。根据Andrew X Zhu的RCT临床研究,靶向药物Ivosidenib使得患者有10.3个月的中位生存期,而安慰剂组仅有7.5个月[16],Abou-Alfa GK等学者也通过RCT实验研究了Ivosidenib在胆管癌中的作用,其结果是实验组的无病生存期为2.7个月(95% CI:1.6~4.2),而安慰剂组的无病生存期为1.4个月(95% CI:1.4~1.6)[17]。A Demols也在胆管癌的靶向治疗上进行了RCT研究,他研究了靶向药Regorafenib对胆管癌作用,最终得出实验组无病生存期为3.0个月(95% CI:2.3~4.9),而对照组无病生存期为1.5个月(95% CI:1.2~2.0),然而实验组的总生存时间和对照组的总生存时间并无统计学差异[18]。可以看出,靶向药能提高患者生存时间,但有研究显示部分靶向药并不能显著提升患者的总生存率[18, 19]。因此需寻找一个更有效的作用靶点。

    1944年,美国学者Kalckar在实验中首次发现了肌苷酸[20]。在随后的科学实践中,更名为腺苷酸激酶AK。AK4定位于细胞线粒体基质内,在肝脏、心脏、脑、肾脏、胃肠道组织中富于表达[21],AK4在细胞能量代谢方面表现出特异性[22],因此他与肿瘤应该存在相关性。2012年由台湾地区学者Yi-Hua Jan完成了首例AK4与癌症关系论证的研究:体外试验中shRNA沉默肺癌细胞CL1-5和A549中的AK4后,两株细胞的侵袭能力下降约50%,从而证实AK4促进肺癌细胞的侵袭[3]。连云港市的学者MinMin HUANG在研究中显示AK4在人浆液性卵巢癌组织中高表达。在体内试验中,AK4敲低组的肿瘤体积明显减小,肿瘤重量明显减轻。这些试验均显示AK4促进了人浆液性卵巢癌的发生发展[4]。Jie Zhang等在Her-2阳性乳腺癌中的研究显示AK4的表达水平与肿瘤TNM分期(P = 0∶017)和淋巴结转移(P = 0∶046) 显著相关。体外试验中,MTT法、细胞划痕实验和Transwell试验都显示敲低AK4组的癌细胞增值、迁移、侵袭能力减弱。体外试验也显示敲低了AK4的肿瘤组织体积减小,重量减轻[5]。此后AK4与肿瘤的研究未曾断绝,田华等学者通过免疫组化等方法证实了AK4在肺腺癌中高表达[23]。李辰运的研究显示AK4在胰腺导管腺癌中高表达,并且与肿瘤分期、淋巴结转移、神经受侵、脉管内瘤栓有相关性(P < 0.05)[24]。李绍军等也证实AK4在食管鳞状细胞中高表达[25],夏林等也通过免疫组化的方式证实了AK4在胃癌中高表达[26],尽管我国的多数学者都明确了AK4在大多数肿瘤中的表达,但是很遗憾,仅有少数人通过体内、体外实验论证AK4对相关癌症的影响,无法将他们的研究进一步转化为临床制定治疗方案的依据。

    本实验首次论证AK4对肝内胆管癌细胞HUCCT1增殖、迁移的影响。首先予siRNA沉默AK4的表达,再通过EdU检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。本次实验的结论与前人的研究结论相似,即AK4促进肝内胆管癌细胞HUCCT1的增殖、迁移。本实验的不足在于,笔者尚未完成AK4对肝内胆管癌细胞其他生物学能力的影响,如EMT、侵袭等等。因此,笔者接下来即将完成其他细胞生物学行为实验,并且探究在机制方面的变化以及通过体内实验验证结论。本实验结论将为肝内胆管癌的临床分子靶向治疗提供基础实验数据,采用生物医学工程技术干预肝内胆管癌组织中AK4的表达,将有助于肿瘤的综合治疗。

  • 图  1  灯盏乙素的化学结构式

    Figure  1.  Chemical structure of Scutellarin

    图  2  灯盏乙素-靶点网络图

    Figure  2.  Scutellarin- target network

    图  3  灯盏乙素-动脉粥样硬化-靶点网络

    Figure  3.  Intersection of Scutellarin predicted targets and atherosclerotic targets

    图  4  灯盏乙素治疗动脉粥样硬化潜在靶点的PPI网络

    Figure  4.  PPI network of potential targets of Scutellarinl on anti-AS

    图  5  核心靶点筛选

    Figure  5.  Core target screening

    图  6  灯盏乙素治疗动脉粥样硬化潜在靶点的GO富集分析

    Figure  6.  GO enrichment analysis of potential targets of Scutellarin for anti-atherosclerosis

    图  7  灯盏乙素治疗AS潜在靶点的KEGG通路分析

    Figure  7.  KEGG pathway analysis of potential targets of Scutellarin on anti- atherosclerosis

    图  8  HE染色结果 (200×)

    A:正常对照组;B:模型组;C:Scutellarin 7 mg/kg组;D:Scutellarin 14 mg/kg组;E:Scutellarin 28 mg/kg组;F:ATV 10 mg/kg组。

    Figure  8.  HE staining results (200×)

    图  9  灯盏乙素对PI3K/AKT/mTOR信号通路及炎症因子的影响[($\bar x \pm s $),n = 6)]

    A-a:PI3K的mRNA 表达;A-b:AKT的mRNA 表达;A-c:mTOR的mRNA 表达。B-a:Bax的mRNA 表达;B-b:Bcl-2的mRNA 表达;B-c:Caspase-3的mRNA 表达。C: 小鼠血清TNF-α的含量。D:小鼠血清IL-1β的含量。与空白对照组相比较,*P < 0.05,** P < 0.01;与模型组比较,#P < 0.05,#P < 0.01。

    Figure  9.  Effects of Scutellarin on PI3K/AKT/mTOR signaling pathway-related genes and inflammatory factors[($\bar x \pm s $),n = 6)]

    表  1  实验涉及的部分数据库

    Table  1.   Main databases involved in the experiment

    名称网址用途
    Pubchem https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 化合物相关信息下载
    Swiss http://www.swisstargetprediction.ch/ 药物相关靶点检索
    Pharm mapper http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/ 药物相关靶点检索
    Genecards https://www.genecards.org/ 疾病相关靶点检索
    Disgenet https://www.disgenet.org/ 疾病相关靶点检索
    Venny https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ 疾病-药物靶点交集图
    Uniprot https://www.uniprot.org/ 靶点名称翻译
    David https://david.ncifcrf.gov/ KEGG、GO分析
    String https://string-db.org/ 蛋白质相互作用网络
    微生信平台 http://www.bioinformatics.com.cn/ 数据处理
    Cytoscape v3.9.0软件 https://cytoscape.org/ 数据处理及绘图
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    表  2  引物序列

    Table  2.   The primer sequence

    引物名称长度(bp)引物序列5′→3′
    PI3K 20 Forward primer:CTTATGTCCTTGGCATTGGT
    Reverse primer:CAAAGTCTATGTGGAAGAGCTG
    AKT1 20 Forward primer:TCACCCAGTGACAACTCAG
    Reverse primer:AAACTCGTTCATGGTCACAC
    Bcl-2 19 Forward primer:TGACTGAGTACCTGAACCG
    Reverse primer:TAGTTCCACAAAGGCATCC
    Bax 19 Forward primer:CTGCAGAGGATGATTGCTG
    Reverse primer:GTCTGCAAACATGTCAGCT
    Caspase-3 21 Forward primer:AACTCTTCATCATTCAGGCCT
    Reverse primer:CCATATCATCGTCAGTTCCAC
    β-actin 20 Forward primer:CTTCCTGGGTATGGAATCCT
    Reverse primer:TCTTTACGGATGTCAACGTC
    mTOR 20 Forward primer:GCAGATTTGCCAACTATCTTCGG
    Reverse primer:CAGCGGTAAAAGTGTCCCCTG
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-03-29
  • 网络出版日期:  2022-07-21
  • 刊出日期:  2022-07-28

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