Platelet-rich Plasma Promotes the Proliferation of Human Endometrial Mesenchymal Stem Cells (EnMSCs) through the PI3K/AKT/mTOR Signaling Pathway
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摘要:
目的 探讨PRP促进EnMSCs增殖的机制，为EnMSCs的扩增及临床应用提供理论基础。 方法 将EnMSCs随机分为对照组、2%PRP组、2%PRP + LY294002组，CCK-8法检测细胞增殖情况；流式细胞仪监测细胞周期及Western Blot和ELISA检测细胞中p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR的蛋白表达。 结果 （1） CCK-8结果显示：与对照组相比较，2%PRP组EnMSCs的增殖水平显著较高(P < 0.05)；与2%PRP组相比，2%PRP+LY294002组EnMSCs的增殖水平显著较低（ P < 0.05）；（2）流式细胞仪分析细胞周期结果显示：2%PRP组G2/M期细胞比例显著高于对照组和2%PRP+ LY294002组，G0/G1细胞比例明显低于对照组和2%PRP+ LY294002组，差异均有统计学意义（ P < 0.05）；（3） 2%PRP组EnMSCs中p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的蛋白表达明显高于对照组及2%PRP+LY294002组，差异均有统计学意义（ P < 0.05）。 结论 EnMSCs的增殖由PI3K/AKT/ mTOR信号通路调控，PRP通过促进AKT、mTOR的蛋白表达及其磷酸化以激活该通路，促进EnMSCs由G1期向G2期转变，从而促进EnMSCs的增殖。 -
关键词:
- 富血小板血浆 /
- 子宫内膜间充质干细胞 /
- PI3K/AKT/mTOR /
- 细胞增殖 /
- 细胞周期
Abstract:Objective To explore the mechanism of PRP promoting EnMSCs proliferation, and to provide a theoretical basis for the expansion and clinical application of EnMSCs. Methods EnMSCs were randomly divided into the control group, 2%PRP group and 2%PRP + LY294002 group. Cell proliferation was detected by CCK-8 method. Cell cycle was monitored by flow cytometry and protein expressions of p-PI3K, AKT, p-AKT, mTOR and p-mTOR were detected by Western Blot. Results （1） CCK-8 results: Compared with the control group, the proliferation level of EnMSCs in 2%PRP group was significantly higher （P < 0.05）. Compared with the 2%PRP group, the proliferation level of EnMSCs in the 2%PRP+LY294002 group was significantly lower （ P < 0.05）. （2） The results of cell cycle analysis by flow cytometry showed that the proportion of cells in G2/M phase in the 2% PRP group was significantly higher than that in the control group and 2% PRP+LY294002 group, and the proportion of cells in G0/G1 phase was significantly lower than that in the control group and 2% PRP+ LY294002 group. All of these had statistically significant differences （ P < 0.05）. （3） The protein expressions of p-PI3K, AKT, p-AKT, mTOR and p-mTOR in EnMSCs in the 2%PRP group were significantly higher than those in the control group and the 2%PRP+LY294002 group, with statistical significance （ P < 0.05）. Conclusion The proliferation of EnMSCs is regulated by the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. PRP activates this pathway by promoting the protein expression and phosphorylation of AKT and mTOR, thereby promoting the proliferation of EnMSCs. -
肺癌是全球最常见的癌症，占所有肿瘤例数的11.6%[1]。根据最新Global cancer statistics统计，每年估计诊断出220万新肺癌病例，约180万例肺癌死亡，造成了重大的社会负担和经济损失[2]。肺癌的早期治疗策略优先考虑解剖性肺切除联合淋巴结清扫。然而，术后治愈率和生存率仍然很低，30%～70%的术后患者出现肿瘤复发或转移，治疗效果非常不理想[3]。因此，确定新型和有效的生物标志物和治疗靶点对于肺癌防治是至关重要。
作为一种重要的细胞内矿物营养物质，铜在几个重要的细胞过程中发挥作用，包括线粒体呼吸、氧代谢、铁摄取以及一些生物途径的调节[4−5]。此前的研究已经观察到铜与疾病状态之间的联系，例如，在各种恶性肿瘤中发现了更高水平的铜[4−5]。最近，Tsvetkov等[6]揭示了一种称为“铜死亡”的新机制，即过高的细内铜浓度会导致细胞死亡。值得注意地。已有研究证实铜死亡参与肺癌的进程。例如，PSMD11被鉴定为铜死亡和免疫相关基因，并且促进肺癌细胞的增殖和转移[7]。此外，AC144450.1/miR-424-5p/CBX2轴被鉴定为铜死亡相关的竞争性内源RNA机制，并且该轴的激活有利于肺癌细胞的生长[8]。这为肺癌治疗干预组合提供了潜在的方向。然而，铜死亡在肺癌中的研究仍然处于初步阶段。
本研究拟通过生物信息学鉴定与肺癌预后和免疫微环境相关的铜死亡基因。旨在为肺癌的治疗提供新型的生物标志物和铜死亡相关的理论基础。
1. 资料与方法
1.1 肺癌数据集和铜死亡相关基因（cuproptosis-related gene，CRGs）的获取
本研究使用的肺癌数据集来源于TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/），包括肺腺癌（lung adenocarcinom，TCGA-LUAD）和肺鳞细胞癌（lung squamous cell carcinomas，TCGA-LUSC）队列。从TCGA数据库提取队列的count和fpkm格式数据。为避免模型构建受到不同队列研究间批次效应的影响，log2转换的fpkm（log2-fpkm）值采用sva包进行批次效应校正，校正中将样本类型（肿瘤或正常组织）作为协变量，避免批次校正掩盖组织类型间生物学效应的差异。最后筛选患者生存信息完整的肿瘤样本数据及所有正常组织样本数据作为分析使用的数据集，其中包括616例肿瘤样本和108例正常组织样本。Count数据用于差异分析，log2-fpkm数据用于预后模型构建。从此前的文献中共检索到38个CRGs[9]，包括ATP7B、CDKN2A、DLD、DPYD、FDX1、GLRX5、GLS、ISCA2、LIPT1、MTF1、NDUFA1、NDUFA8、NDUFB10、NDUFB2、NDUFB6、NDUFC1、NDUFC2、NDUFV2、PDHA1、PLAT、POLD1、PPAT、SLC31A1、SDHB、TIMMDC1、DLAT、GCSH、DBT、DLST、LIAS、LIPM、LIPA、LIPT2、PDHB、ACO2、NLRP3、ATP7A和NFE2L2。
1.2 差异表达的CRGs（differentially expressed cuproptosis-related gene，DE-CRGs）的鉴定
采用R软件Deseq2包[10]对TCGA肺癌队列count格式数据执行差异表达分析，以鉴定差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。阈值为|log2-fold change （FC）|≥2且校准的P-value<0.05。采用R软件ggplot2包[11]可视化DEGs的火山图。采用R软件VennDiagram包[12]获取和可视化DEGs和CRGs的交集，以鉴定DE-CRGs。
1.3 DE-CRGs的富集分析
DE-CRGs的富集分析包括GO和KEGG富集分析，以识别DE-CRGs的生物学功能和可能涉及的信号通路。DE-CRGs采用R软件clusterProfiler包[13]进行GO和KEGG富集分析，并采用R软件ggplot2包[11]进行气泡图的可视化。
1.4 DE-CRGs相关蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建
采用STRING数据库预测DE-CRGs的互作关系。最低要求的互作分数设置为中等可行度（0.4）。DE-CRGs互作关系的TSV从STRING数据库导出，并且导入Cytoscape软件。通过Cytoscape软件的Network Analysis进行PPI网络的可视化，并统计每个节点的连接度、介数中心性和接近中心性。
1.5 DE-CRGs与肺癌患者预后的相关性分析
采用R软件Survival包[14]进行TCGA肺癌队列log2-fpkm格式数据（共616个肺癌样本，包括344例死亡和272例存活）的Log-rank检验和Cox回归分析，以识别DE-CRGs表达和临床特征（年龄、性别、是否吸烟、TNM分期、残留肿瘤情况）与肺癌患者预后的相关性，筛选可以独立用于预后风险预测的DE-CRGs。计算每个变量的风险比（hazard ratio，HR）和95%置信区间（confidence interval，CI）。P-value<0.05被认为具有统计学意义。采用R软件survminer包进行森林图和K-M曲线的可视化。将上述筛选出的独立临床因素用于预测列线图的构建。使用R软件rms包[15]构建预测列线图和相应的校准曲线。校准曲线越接近代表最佳预测的45°线，代表列线图的预后预测性能越好。
1.6 DE-CRGs与肺癌患者免疫微环境的相关性分析
本研究采用CIBERSORT和ESTIMATE算法评估LIPT1表达与肺癌患者免疫微环境的相关性。CIBERSORT算法是基于线性支持向量回归原理对人类免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的一种算法[16]。本研究通过CIBERSORT算法分析了肺癌队列中22种人类免疫细胞亚群的比例，及LIPT1表达与22种免疫细胞浸润的相关性。Estimate算法通过使用表达数据预测恶性肿瘤组织中的基质细胞和免疫细胞存在的工具[17]。本研究通过ESTIMATE算法评估肿瘤纯度，并分析LIPT1与免疫分数和基质分数之间的相关性。
1.7 统计学分析
采用R软件（版本4.1.1）进行统计分析。Student's t检验和Mann-Whitney检验用于比较肺癌组织和正常组织之间的基因表达。采用Kaplan-Meier（K-M）曲线及Log-rank统计检验对高表达LIPT1和低表达LIPT1的患者生存进行差异分析。使用单变量和多变量Cox回归分析来确定肺癌的独立的预后因素。P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 肺癌中DE-CRGs的鉴定
R软件Deseq2包分析显示，相较于正常组织，TCGA-LUAD和TCGA-LUSC队列的肺癌组织中共存在
5269 个DEGs，包含1130 个下调的DEGs和4139 个上调的DEGs，见图1A。韦恩图显示，DEGs和CRGs共存在11个交集，包括POLD1、DLD、ACO2、DLST、NDUFA1、DBT、NDUFB10、LIPT1、DLAT、NDUFB6、GLRX5，见图1B。这些交集为DE-CRGs。
图 1 肺癌中DE-CRGs的鉴定A：火山图展示了TCGA-LUAD和TCGA-LUSC队列中DEGs的表达和差异性。每个点代表一个基因；红色和蓝色的点分别代表上调和下调DEGs；灰色的点代表表达没有显著差异性的基因；B：韦恩图展示了DEGs和CRGs的交集和并集数量。Figure 1. Identification of DE-CRGs in lung cancer2.2 肺癌中DE-CRGs的富集分析
GO富集分析显示，11个DE-CRGs主要参与有氧呼吸、硫化合物代谢过程、氨基酸分解代谢过程、三羧酸循环和ATP代谢过程的调控，见图2A。KEGG富集分析显示，11个DE-CRGs主要调控碳代谢、氧化磷酸化、氨基酸代谢、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢和柠檬酸循环，见图2B。
图 2 肺癌中DE-CRGs的富集分析A～B：气泡图展示了DE-CRGs的（A）GO和（B）KEGG富集分析的结果。点的大小代表富集到对应术语中的DE-CRGs数量；点的颜色代表校准的P值的大小，颜色越蓝代表校准的P值越小。Figure 2. Enrichment analysis of DE-CRGs in lung cancer2.3 肺癌中DE-CRGs相关PPI网络的构建
DE-CRGs相关PPI网络包含10个节点和19个互作关系对，其中不包含POLD1，见图3A。该网络中，DLST、ACO2、DLD、DLAT、DBT是连接度排名前五的DE-CRGs，见图3B。
图 3 肺癌中DE-CRGs相关PPI网络的构建A：基于STING数据库和Cytoscape软件构建的DE-CRGs相关PPI网络。节点越大代表连接度越大；B：表格展示了每个节点的连接度、介数中心性和接近中心性。Figure 3. Construction of DE-CRGS-related PPI networks in lung cancer2.4 与肺癌患者预后相关的DE-CRGs鉴定
单因素COX分析表明，11个DE-CRGs中仅有DBT和LIPT1与肺癌患者生存相关，见图4A。进一步的多因素COX分析表明，LIPT1、年龄、TNM分期和残留肿瘤是肺癌患者的独立风险因素，见图4A。Log-rank检验同样表明，相较于高表达LIPT1的肺癌患者，低表达LIPT1的肺癌患者的生存可能更低，见图4B。本研究构建了预测肺癌患者预后的独立风险因素相关列线图，见图4C。校准曲线显示，在第1年、第2年和第3年，列线图预测的患者生存可能与患者实际的生存/结局相近，见图4D。
图 4 与肺癌患者预后相关的DE-CRGs鉴定A：单因素和多因素COX分析识别与肺癌患者生存相关的DE-CRGs和临床特征；B：Log-rank检验鉴定LIPT1表达与患者生存可能的相关性；C：基于LIPT1、年龄、TNM分期和残留肿瘤构建的列线图，以预测肺癌患者的生存可能；D：列线图的校准曲线，以观察列线图的预后预测性能。Figure 4. Identification of DE-CRGs associated with prognosis in patients with lung cancer2.5 LIPT1与肺癌患者免疫微环境相关
ESTIMATE算法分析显示，LIPT1表达与肺癌患者的免疫分数、基质分数和ESTIMATE分数呈现显著的负相关，见图5A。CIBERSORT算法分析显示，LIPT1表达与T细胞滤泡辅助细胞、静息肥大细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、M1和M2型巨噬细胞、γδ T细胞、活化的自然杀伤细胞细胞、CD8+ T细胞的浸润呈现正相关，与M0型巨噬细胞、激活的肥大细胞、浆细胞、中性粒细胞、静息的自然杀伤细胞和Treg细胞显现显著的负相关，见图5B。
图 5 LIPT1与肺癌患者免疫微环境的相关性分析A：ESTIMATE算法识别LIPT1表达与免疫分数、基质分数和Estimate分数的相关性；B：CIBERSORT算法鉴定LIPT1表达与22种免疫细胞浸润的相关性。Figure 5. Correlation analysis of LIPT1 and immune microenvironment in patients with lung cancer3. 讨论
本研究在肺癌中共鉴定了11个DE-CRGs，包括ACO2、POLD1、DLD、DLST、NDUFA1、DBT、NDUFB10、LIPT1、DLAT、NDUFB6、GLRX5。有趣地，部分DE-CRGs在肺癌进程中的功能已被证实。Shideh等[18]证实，ACO2在非小细胞肺癌组织中低表达，这预示这患者预后变差，并且ACO2通过抑制CISD1导致铁饥饿反应来降低FeS转运，这抑制了癌细胞的增殖。此外，PM2.5通过翻译和转录激活DLAT介导的糖酵解重编程，这加速了非小细胞肺癌的生长[19]。然而，这些研究均不涉及铜死亡的调控。结合本研究的发现提示，ACO2和DLAT对肺癌的抑癌和促癌作用可能与铜死亡有关。值得注意地，富集分析证实，11个DE-CRGs主要调控能量代谢。这是可以预见的。因为，过量的铜会损害线粒体呼吸中的三羧酸循环，并刺激铜中毒，导致脂酰化和FeS簇蛋白的明显丢失以及热休克蛋白70水平的增加，进而引起细胞的程序性死亡[6]。
本研究证实，LIPT1低表达是肺癌的独立风险因子，并且LIPT1相关的列线图对肺癌患者预后具有卓越的预测性能。LIPT1是编码线粒体硫辛酸代谢的重要基因，其编码的LIPT1蛋白将硫辛酰基从硫辛酰腺苷酸转移到甘氨酸裂解系统蛋白H和2-氧酸脱氢酶E2亚基，进而参与硫辛酸代谢[6，20]。目前，有关于LIPT1的研究主要集中于Leigh综合征[21]、硫辛酸代谢相关的致命疾病[22]、恶性肿瘤（膀胱癌、黑色素瘤和肝细胞癌）[23−25]。在膀胱癌和黑色素瘤中，LIPT1的高表达预示着患者预后良好，这与本研究的结果是一致的。然而，在肝细胞癌中，LIPT1表现为高表达，并且是肝细胞癌预后不良的独立风险因素。这表明，LIPT1在不同细胞类型中以完全相反的方式发挥作用，这一点对于理解癌症中的细胞命运决定至关重要。然而，LIPT1在肺癌发生和发展中的功能是未知的，尤其是对铜死亡的调控。值得注意地，在黑色素瘤患者中，上调的LIPT1表达可能会抑制Treg的浸润，从而提高免疫治疗效果[24]。本研究发现，LIPT1表达与Treg的浸润呈现显著的负相关。这个发现提示，LIPT1可能也通过调控Treg的浸润，参与肺癌免疫治疗疗效的干预。此外，本研究还发现，LIPT1表达与T细胞滤泡辅助细胞、肥大细胞、树突细胞、巨噬、γδ T细胞、自然杀伤细胞细胞、CD8+ T细胞和中性粒细胞的浸润有关。这些发现表明，LIPT1可能是肺癌免疫治疗的有效靶点，为肿瘤患者的临床治疗提供了新的希望。然而，LIPT1表达与癌症患者免疫检查点之间的关联仍需在更多的临床前和临床试验中探索。
综上所述，本研究利用生物信息学分析探讨了与肺癌患者预后和免疫微环境相关的铜死亡基因。本研究证实，LIPT1是一种有效预测肺癌患者预后，并且与肿瘤免疫微环境相关的铜死亡生物标志物。本研究为进一步研究LIPT1在肺癌发生和治疗中的具体机制奠定了基础。
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图 1 各组48h EnMSCs生长情况（×200）
A：对照组；B：2%PRP组；C：2%PRP + LY294002组
Figure 1. The 48 h EnMSCs proliferation phenomena for each group （×200）
图 2 3组CCK-8增殖结果比较
与对照组比较，**P < 0.01。
Figure 2. The CCK-8 proliferation results comparison between the three groups
图 3 各组流式细胞周期及细胞周期比例图
A：各组流式细胞周期图；B：细胞周期比例图。
Figure 3. The flow cell cycle and cell cycle proportion gram in three groups
图 4 3组p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平比较
A：Western blot结果；B：ELISA结果。
Figure 4. The p-PI3K, AKT, p-AKT, mTOR, and p-mTOR proteins demonstration levels comparison between the three groups
表 1 3组EnMSCs细胞周期比例（%）比较（n = 3）
Table 1. The EnMSCs cell cycle proportion comparison in the three groups （n = 3）
组别 G1/G0（%） S（%） G2/M（%） 对照组 70.04 ± 2.67 25.49 ± 2.68 4.47 ± 1.04 2%PRP组 54.63 ± 4.23**▲ 30.66 ± 2.85*▲ 14.71 ± 2.72**▲ 2%PRP+ LY294002组 72.16 ± 4.26 17.45 ± 3.49** 10.39 ± 2.84** 与对照组比较，*P < 0.05, **P < 0.01；与2%PRP+ LY294002组比较， ▲P < 0.01。 
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