2019年末，一种原因未明的肺炎快速在湖北武汉流行，并在全国各地大面积传播^[1-2]。2020年1月初，科学家们将这一病毒从感染患者中分离出；2月11日，国际病毒分类委员会将该病毒命名为2019 新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）；同日，此病被WHO正式命名“COVID-19”，即新型冠状病毒肺炎^[3]。现今，世界区域内第2波COVID-19疫情迅猛来袭。基于WHO发布于2020年11月18日的数据可知，世界范围内单日病人新增量为45万人^[4]，许多国家重新“封城”，而我国境外输入病例逐渐增多，围绕COVID-19开始又一轮防控。现今因2019-nCoV感染引发的 COVID-19 已被收录至我国“传染病防治法”所示乙类传染病内，同时其预防与控制措施按照甲类传染病标准实施。参照国家卫生健康委员会（National Health Commission）办公厅联合国家中医药管理局（NATCM）办公室发布的试行第8版修订版《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》^[5]，主要临床症状为发热与/或呼吸道症状，发病初期白细胞（WBC）总量无异常或下降，或淋巴细胞（Lym）计数下降。对此病确诊，应满足下述任一病原学证据：（1）血液（或呼吸道）标本荧光定量实时 PCR 测定SARS-CoV-2阳性；（2）血清学检查：2019-nCoV特异性IgG抗体、IgM抗体皆阳性，发病7d内常显示阴性。同时在实验室检查环节，进行鼻、尿液、咽拭子、粪便、痰、血液、下呼吸道分泌物等标本测定，能够发现2019-nCoV核酸^[5]。但现今报道其它类型的生物标本 2019-nCoV 核酸测定结果尚少，本研究利用实时荧光定量RT-PCR方法检测确诊的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）患者的多种生物样本中SARS-CoV-2 核酸的带病毒状况，对机体不同系统中SARS-CoV-2的状态展开观察，并分析其临床价值，为COVID-19 临床诊断环节标本类型如何选择以及怎样提升核酸检出率给予借鉴。

1.   对象与方法

1.1   对象

昆明市第三人民医院是昆明市规定的一所COVID-19定点收治医疗机构，该院首例确诊病例的收治时间是在2020年1月30日。此项研究的观察对象为该院2020.01.30～2020.10.31期间医治的53名COVID-19患者。新冠肺炎诊断标准、治疗方案、疾病分析、出院标准、病毒核酸转阴的标准均按照《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》^[6]执行。所有病例均经过核酸检测（包括院内检测及昆明市疾控中心检测），收集病例性别、年龄、首发症状、发病时间和疾病转归资料等通过查找临床病例资料获得。

1.2   方法

1.2.1   样本

按昆明市第三人民医院制订的《新型冠状病毒确诊或疑似患者样本采集及运送流程》，本研究收治的新冠肺炎患者入院后均为确诊患者，入院后由主管医师于3级防护条件下，在隔离病房按照时间顺序（0～7 d、8～14 d、≥15 d）采集确诊病例，严格按照同一患者同一时间采集鼻拭子、咽拭子、痰液、粪便和尿液样本，放入转运箱中运送至昆明市第三人民医院检验科核酸检测室，30 min内送检。转运箱外侧含氯消毒液（有效氯含量2000 mg/L）喷洒，专车专用。

1.2.2   试剂

实验中，所用2019-nCoV的ORF1ab/N基因测定试剂盒分别为天隆生物科技公司（苏州）、达安基因公司（广州）产品，批号分别为“P73200119”、“ 2020087”，两试剂盒采用的皆为荧光PCR法，另提取试剂盒的批号为“E0119110421”。

1.2.3   仪器

西安天隆科技有限公司生产提供的NP968‐C全自动核酸提取仪（磁珠法），天隆核酸扩增（GENTIER 96）和美国伯乐科技公司提供的CFX96 Real-Time System核酸扩增仪。

1.2.4   实验方法

实验人员规范遵循《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》 ^[7]、第2版《新型冠状病毒实验室生物安全指南》^[8]，还有第2版《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》^[9]所示相关内容开展实验操作与生物安全防护。

引物和荧光探针存在ORF1ab基因（FAM 区域靶标）、N基因（HEX区域靶标）这两个靶序列。前者，上游（F）、下游（R）引物各为“CCCTGTGGGTTTTACACTTAA”、“ ACGATTGTGCATCAGCTGA”。后者，上游（F）、下游（R）引物各为“GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT”、“CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG”。两者荧光探针（P）分别为“5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGG-AAAGGTTATGG-BHQ1-3'”、“5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'”。

（1）样本处理：把样本移至培养箱内，在56 ℃温度设定下，实施0.5 h灭活处理。之后，分别处理不同类型样本；（2）咽拭子与鼻拭子：先完全混合，再吸取0.2 mL用来提取核酸；（3）尿液：先完全混合，再吸取0.2 mL，用于核酸提取；（4）痰液：与0.4 mL病毒保存液完全混合，再吸取0.2 mL用于核酸提取；（5）粪便：取约1 g大便（大小如同黄豆），并移至EP管（1.5 mL）内，之后向其中添加1 mL生理盐水，再经10 s振荡使完全混合，接着于3000 r/min转速下实施0.5 min离心处理；将0.2 mL上清移至新EP管内，在转速为12000 r/min时，实施5 min离心，将上清倒掉，添加1 mL生理盐水，充分混合，于12 000 r/min转速下实施10 min离心处理，取0.05 mL下层沉淀用于核酸提取。

以上标本均使用天隆（TIANLONG）全自动核酸提取仪，提取操作规范应参照试剂说明书。

（6）核酸扩增：借助天隆核酸扩增仪，根据相应厂家试剂说明书，完成反应体系的制备，在实施扩增测定，同时判定检测结果的阳性、阴性；（7）结果判定；① 采用苏州天隆生物科技有限公司生产的新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab/N基因检测试剂盒，在满足以上质量控制条件，开展下述分析（FAM 通道、VIC 通道分别是2019-nCoV病毒的ORF1ab基因区、N 蛋白区）；若待检样本测定结果FAM通道与VIC通道Ct值皆≤37，同时显示S型曲线，以及存在明显指数增长期，那么能够判定是2019-nCoV核酸阳性；若待检标本FAM通道与VIC通道，只有其中1个通道的测定结果Ct值在37及以下水平，那么应对样本实施重复测定，倘若重复测定结果为2个通道的Ct值皆在37及以下水平，显示S型曲线，同时存在明显指数增长期，那么判定为2019-nCoV核酸阳性；若依然存在1个通道测定结果显示阳性表现，那么此样本属于疑似样本，需借助其它手段（诸如测序等）开展序列鉴定；倘若2个通道测定Ct值未显示数值，内标通道测定显示是阳性结果，可判定是2019-nCoV核酸阴性。②借助2019-nCoV的ORF1ab/N基因测定试剂盒（为广州达安基因公司产品），同时满足上述质量控制要求，开展下述分析：用来测定标本内SARS-CoV-2 RNA（ORF1ab探针、N基因探针分别应用Yellow、FAM标记），此外，通过Cy5来标记内标基因探针，用以监控标本采集、提取核酸操作、PCR扩增操作，能够使假阴性结果发生率下降。

若测定样本在FAM与VIC通道未显示扩增曲线，或者Ct值在40以上，同时Cy5通道存在扩增曲线，就明确样本内不存在2019-nCoV RNA；若测定样本与FAM以及VIC通道Ct值为40及以下水平，同时见明显的扩增曲线，就能够判定样本2019-nCoV呈阳性；若测定样本值于FAM（或VIC）单一通道Ct值为40及以下，剩余通道未见扩增曲线，应采取复检处理，若复检结果相同，就能够判定样本2019-nCoV呈阳性；若复检皆显示阴性，就可明确样本内不存在2019-nCoV RNA。（8）质量控制：对于每批试验，不包括试剂自带的阳性参照在内，还应将3个孔设置为阴性提取参照，所用试剂为生理盐水，将灭活的阳性标本稀释分装作为弱阳性提取对照，随机放在标本中间同步提取，3孔阴性、阳性、弱阳性参照测定结果皆在控，那么此批次试验具有效性，不然则不具有效性。

1.3   统计学处理

在本次研究的统计学分析部分，借助的软件有Excel2003与SPSS22.0，针对检测阳性率，借助χ²检验开展差异性分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   病例信息

此项研究医治的53名COVID-19患者中，重症、轻症、无症状感染患者的例数依次为5例、34例、14例，所有患者无其他并发症，预后良好。

2.2   不同病程新型冠状病毒核酸检测

送检不同类型生物样本（鼻拭子、咽拭子、痰液、粪便和尿液样本）共563份。第1周共有156份样本，咽拭子、鼻拭子、痰液样本依次占53份、53份、50份。在第2周共有245例送检样本，其中鼻拭子有53份，咽拭子有52份，痰液样本有49份，38份粪便样本，53份尿液样本。在第3周后，共有162例送检样本，其中咽拭子占45份，鼻拭子占43份，痰液样本占27份，19份粪便样本，28份尿液样本，见图1。

图  1  不同病程不同生物样本新型冠状病毒核酸检测情况

Figure  1.  Detection of SARS-CoV-2 nucleic acid in different biological samples with different course of disease

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第1周鼻拭子，咽拭子和痰液样本核酸检出率分别为88.67%（47/53），73.58%（39/53）和54.00%（27/50）。第2周鼻拭子，咽拭子，痰液样本和粪便样本核酸检出率分别为79.24%（42/53），53.85%（28/52），32.65%（16/49）和13.16%（5/38）。在第3周后鼻拭子，咽拭子，痰液样本和粪便样本核酸检出率分别为13.95%（6/43），4.44%（2/45），11.11%（3/27）和10.52%（2/19）。在发病第1～7 d和8～14 d，鼻拭子阳性检出率为88.67%（47/53）和79.24%（42/53），而咽拭子阳性检出率为73.58%（39/53）和53.85%（28/52），在阳性检出率方面，相较咽拭子，鼻拭子偏高，见表1、表2。

表  1  不同病程不同生物样本新型冠状病毒核酸检测

Table  1.  Detection of SARS-CoV-2 nucleic acid in different biological samples with different course of diseas

收集日期	样本类型	新型冠状病毒肺炎病例 （COVID-19 ）			χ2	P
		例数 n	阳性数	阳性率 （%）
0～7 d	鼻拭子	53	47	88.67	15.55	< 0.001*
阳性	咽拭子	53	39	73.58
	痰液	50	27	54.00
	粪便	/	/	/
	尿液	/	/	/
8～14 d	鼻拭子	53	42	79.24	88.08	< 0.001*
阳性	咽拭子	52	28	53.85
	痰液	49	16	32.65
	粪便	38	5	13.16
	尿液	53	0	0.00
≥15 d	鼻拭子	43	6	13.95	5.78	0.216
阳性	咽拭子	45	2	4.44
	痰液	27	3	11.11
	粪便	19	2	10.52
	尿液	28	0	0.00
*P < 0.05。

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2.3   不同病程不同病程新型冠状病毒核酸检测阴转情况

在53例确诊患者中，发病时间未超过7 d者鼻拭子、咽拭子核酸测定显示阳性的例数各为47例、39例，27例痰液核酸检测阳性，前期未收集粪便和尿液样本用于核酸检测。昆明市第三人民医院新冠患者抗病毒治疗2周左右效果显著，在病程推进下，咽拭子、鼻拭子、粪便与痰液样本核酸阳性检出人数不断减少，见图2。据此以发病15 d前后来分析核酸检测结果，发现在发病15 d后病毒核酸Ct值与15 d内相比病毒核酸载量不同的生物样本检测没有明显差异（P > 0.05）。粪便样本在患者的病程中核酸检测阳性率12.28%（7/57），而尿液样本均未检测出病毒核酸，见表3。

图  2  不同病程不同生物样本新型冠状病毒核酸检测

Figure  2.  Detection of SARS-CoV-2 nucleic acid in different biological samples with different course of disease

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3.   讨论

目前，全球COVID-19疫情防控形势依然很不乐观，此病病原体SARS-CoV （严重急性呼吸综合征冠状病毒）-2属于β属冠状病毒中的Sarbecovirus亚属，此病毒的基因和源自蝙蝠的bat-SL-CoVZC45、bat-SL-covzcx21这2类冠状病毒的同源性达88%，和SARS-CoV基因呈79%左右的同源性，但和MERS-CoV （中东呼吸系统综合征冠状病毒）只有50%的同源性^[10-12]，边缘见如日冕形状的突起，显示为多形性（椭圆形、圆形等），直径达60 nm至140 nm^[13]。COVID-19正浸侵整个世界，因其致死的人数众多，对公共卫生安全造成极大威胁，此新型高传染性疾病存在较强的传染性，尚无针对病毒的特效药物，疫情管控依赖于早期准确的诊断与严格的隔离措施。SARS-CoV-2核酸的检出是COVID-19感染确诊的金标准，故及时得到准确的病毒核酸结果，除了对患者隔离的及时实施、有效治疗的及时开展、疫情的进一步控制起到积极作用，同时对病人的密切接触人员的识别、医学观察人员的接触有所帮助，如此对宝贵医疗资源的节省有利。

此项研究在所有观察对象对同一病例多种生物样本的病毒核酸开展测定，从而观察2019-nCoV在泌尿道、消化道与呼吸道的分布状况。

通过描述性的统计发现，在新冠肺炎患者发病的不同阶段，鼻拭子、咽拭子、痰液样本有较高的核酸检出率，这与COVID-19临床中主要症状表现为呼吸道症状保持一致。发病第1～7 d，分别为88.67%（47/53），73.58%（39/53）和54.00%（27/50），而≥15 d，鼻拭子，咽拭子，痰液样本和粪便样本核酸检出率分别为13.95%（6/43），4.44%（2/45），11.11%（3/27）和10.52%（2/19）。而COVID-19病人尿液样本内没有发现病毒核酸，可以推测如果尿液内检出病毒核酸可用于预测危重型与否尚应开展更为深入的分析^[14]。

本研究同时发现，在发病第1～7天和8～14 d，鼻拭子阳性检出率为88.67%（47/53）和79.24%（42/53），而咽拭子阳性检出率为73.58%（39/53）和53.85%（28/52），在阳性检出率此项指标上，鼻拭子相较咽拭子偏高。2020年2月10日～21日期间，刘焱斌^[15]对已确证的100名COVID-19患者同期进行鼻拭子、咽拭子样本的SARS-CoV-2核酸测定，在阳性检出率方面，咽拭子、鼻拭子各是54%（54/100）、89%（89/100），后者显著偏高，差异具备统计学价值，可见鼻拭子阳性率相较咽拭子偏高。Zou^[16]对17例COVID-19病例在出现症状后，检测不同病程中咽拭子和鼻拭子标本中ORF1ab基因Ct值，发现发病后约9天内鼻拭子标本中Ct值低于咽拭子，认为在病毒含量方面，鼻拭子样本相较咽拭子偏高，还没有基于病程对2类样本中Ct值开展统计分析。Xu等^[17]报道病例解剖发现：新冠肺炎主要引起深部气道和肺泡损伤为特征的炎症反应。病毒主要破坏下呼吸道，因此下呼吸道样本需经支气管镜检查才能获得，临床应用受部分限制。

从本研究送检鼻拭子（149份），咽拭子（150份），痰液（126份）核酸检测结果显示，3种样本核酸检测结果存在不一致，考虑原因首先可能与患者病毒载量相关。目前本院实验室SARS-CoV-2检测只有定性，患者的病毒载量到达一定阈值后，定性检测才能呈阳性结果，而发病早期病毒载量可达到阳性检测阈值，恢复期病毒载量普遍低于阳性检测阈值甚至消失，使得3类标本的核酸测定结果缺乏一致性。其次可能与样本的采集位置及操作方法有关，鉴于当前疫情防控工作的重要性，应提高病例诊断准确率，建议规范标本采集技术。

本研究从送检的粪便样本核酸检测阳性率12.28%（7/57）提示，SARS-CoV-2有粪-口传播可能，而且消化道也可能是病毒感染的潜在靶器官^[18-19]。同时结果还显示，粪便阳性病人的咽拭子也存在较高阳性率表现，原因可能是，病毒通过呼吸道分泌物侵入至消化道，但原因也可能是消化道黏膜屏障受损，所以SARS-CoV-2入侵消化道与否还应通过进一步研究来明确。此项研究中，一些病例在核酸检测中，咽拭子样本显示阴性，但粪便（消化道）测定显示阳性，原因可能在于，在病毒清除时间上，相较呼吸道，消化道存在延迟表现^[20]。粪便标本内病毒核酸测定显示阳性，表明切实存在病毒，因此，防止生态环境的污染也应引起重视，应对患者排泄物进行彻底消毒^[21]。

此次研究对COVID-19病人多种生物标本的病毒核酸测定结果展开分析，进一步了解新型冠状病毒在鼻拭子、咽拭子、痰液、粪便样本和尿液等不同标本，不同时间SARS-CoV-2阳性率、存在时间和病毒含量方面的数据，为临床控制与诊断疾病给予科学指导。此次研究发现可为2019-nCoV核酸实验室样本测定时样本的选择给予一定借鉴，对评估疾病疗效、预后及疫情防控有积极的意义。