Intestinal Flora in Uricase-Deficient Rats
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摘要:
目的 观察雄性尿酸酶缺失大鼠（Kunming-DY，即KDY大鼠）肠道和新鲜粪便的菌群变化。 方法 与同性别同日龄野生型SD大鼠对照，选取45日龄雄性尿酸酶缺失大鼠称体质量，乌拉坦麻醉后解剖取血制备血清，将小肠依次分成18段，结肠分成2段（每段5 cm）。用磷钨酸法检测血清尿酸含量，用DNA提取试剂盒提取各肠段和新鲜粪便DNA，采用特异性16s rDNA引物扩增后进行高通量测序，将测序结果与数据库比对在门、纲、目、科和属水平鉴定菌群。 结果 45 d日龄时，KDY大鼠体质量下降（P < 0.05），但血尿酸水平明显升高（ P < 0.05），肠道菌群多样性呈降低趋势（ P < 0.05），但粪便菌群多样无明显变化（ P > 0.05）。KDY大鼠肠道和粪便中乳酸杆菌属丰度明显增加（ P < 0.05）。 结论 相比野生型SD大鼠，KDY大鼠肠道菌群多样性下降，但肠道和粪便中的乳酸杆菌属丰度明显增加。 -
关键词:
- 尿酸酶缺失 /
- Kunming-DY大鼠 /
- 高尿酸血症 /
- 肠道菌群 /
- 乳酸杆菌属
Abstract:Objective To investigate the intestinal flora in male uricase-deficient rats （Kunming-DY, KDY rats） compared with wild-type SD rats of the same sex and age. Methods 45-day-old male uricase-deficient rats were weighed, and their blood was collected to obtain serum after they were anesthetized with uratan. Their small intestine was divided into 18 segments, and the colon was divided into 2 segments （5 cm each）. The serum uric acid （SUA） was detected by phosphotungstic acid method. DNA in intestinal segments and fresh feces was extracted using DNA extraction kit. High-throughput sequencing was performed after amplification with specific 16S rDNA primers. Results At 45 days of age, the body mass of KDY rats decreased （P < 0.05）, but the SUA level increased significantly （ P < 0.05）. The intestinal microbiota diversity in KDY rats decreased （ P < 0.05）, but their fecal microbiota diversity did not change significantly （ P > 0.05）. The abundance of Lactobacillus in intestinal tract and feces of KDY rats was significantly increased （P < 0.05）. Conclusion Compared with wild-type SD rats, the intestinal microbiota diversity of KDY rats decreased, but the abundance of Lactobacillus in intestinal tract and feces increased significantly. -
Key words:
- Uricase deficiency /
- Kunming-DY rats /
- Hyperuricemia /
- Intestinal flora /
- Lactobacillus
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高尿酸血症是危害人类健康的“第四高”，与痛风、高血压、糖尿病等常见病关系密切[1]。高尿酸血症的有效防治已经成为临床和实验研究的热点。虽然基于正常实验动物大小鼠，采用药物或食物建立高尿酸血症的模型层出不穷[2]，但这些动物表达的尿酸酶则是贴近临床研究的障碍。近年来，尿酸酶缺失的大小鼠实验动物已经成功研制[3-4]，但尿酸酶缺失后肠道菌群会发生什么改变一直未见系统报道。考虑到肠道也是尿酸排泄的重要途径，肠道菌群可能也具有一定的贡献[5-6]。本研究以同龄野生型大鼠为对照，系统观察尿酸酶缺失大鼠（Kunming-DY，KDY大鼠）肠道和粪便菌群变化，为进一步研究KDY大鼠血尿酸变化与肠道菌群的关系提供实验依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
雄性尿酸酶缺失大鼠，即KDY大鼠由课题组前期采用CRISPR/Cas9技术研制[4]，45 d日龄，按照SPF标准饲养，自由进食饮水，环境温度（22±2）℃，模拟自然光照。对照鼠为雄性SPF级SD大鼠，45 d日龄，由简阳达硕动物科技有限公司提供。
尿酸检测试剂盒（磷钨酸法）购自南京建成生物工程研究所，全波长酶标仪（K6600A型）由北京凯奥科技发展有限公司生成。其他试剂或仪器也均为国产。
1.2 动物实验
随机取6只45 d日龄雄性KDY大鼠为尿酸酶缺失组（Uox-/-），随机取6只45 d日龄SD大鼠为对照组（WT）。日龄45 d时，称重，收集每只大鼠的新鲜粪便。随后乌拉坦（1 g/kg）麻醉大鼠，剪开腹腔，从腹主动脉取血制备血清。其中各组取3只大鼠肠道（十二指肠到结肠末端），摊成110 cm（其中小肠90 cm，盲肠10 cm，结肠10 cm），每5 cm取样于试管中。用干冰保存送样到上海生工生物工程（上海）有限公司提取DNA进行16SrDNA测序。
1.3 尿酸测定
血尿酸按照试剂盒说明书检测。
1.4 菌群16SrDNA高通量测序
样品中的DNA采用E.Z.N.A™ Mag-Bind Soil DNA Kit（OMEGA）试剂盒进行提取，采用Qubit3.0 DNA检测试剂盒（Life）对提取的样品进行精确扩增，扩增引物选择原核生物V3～V4引物（341F：CCTACGGGNGGCWGCAG和805R：GACTACHVGGGTATCTAATCC进行第1轮扩增。随后加入Illumina桥式PCR兼容引物进行第2轮扩增建立DNA文库进行高通量测序[7]。测序在数据分析上：采用QIIME进行质控过滤掉不符合要求的DNA序列，应用UPARSE算法一致性水平达到97%以上的序列进行OTU聚类，用UCLUST分类法联网与SILVA数据库注释分析，采用R语言分析群落组成分。在原核微生物类别上根据算法依次在门、纲、目、科和属水平进行归类并进行相对丰度（%）计算。
1.5 统计学处理
数据用均数±标准差 $\bar x \pm s $表示，对于符合正态分布的数据进行t检验（方差齐）或校正t检验（方差不齐），以P < 0.05表示有统计学意义。
2. 结果
2.1 大鼠血尿酸和体重变化
自由饮食状态下，正常野生型SD大鼠的血尿酸约为11.77～14.69 μg/mL。尿酸酶缺失的KDY大鼠血尿酸水平显著升高到64.71～78.51 μg/mL之间，部分动物已经达到高尿酸血症的诊断标准（图1A）。尿酸酶缺失的KDY大，鼠血尿酸水平显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。尿酸酶缺失后，比同龄雄性野生型SD大鼠的体重明显减轻，即从250 g减轻到170 g左右，差异有统计学意义（ P < 0.05），见 图1B。
图 1 KDY大鼠的血尿酸水平和体重变化[（ $\bar x \pm s $），n = 6]A：45 d龄大鼠血清尿酸水平；B：45 d龄大鼠体重（$\bar x \pm s $ Figure 1. Changes of blood uric acid level and body weight in KDY rats[（ $\bar x \pm s $），n = 6]2.2 KDY大鼠肠道菌群变化
从十二指肠开始，同龄KDY大鼠各节段肠道的微生物分布在门（图2A）、纲（图2B）、目（图2C）、科（图2D）和属（图2E）水平与SD大鼠均有明显不同。总体上看，KDY大鼠各肠段的微生物多样性在门、纲、目、科以及属水平均呈下降趋势。有意思的是与SD大鼠相比，KDY大鼠各肠段乳酸菌属（Lactobacillus）（图2E）及相应的门（Firmicutes，厚壁菌门，图2A）、纲（Bacilli，芽孢杆菌纲，图2B）、目（Lactobacillales，乳杆菌目，图2C）、科（Lactobacillaceae，乳杆菌科，图2D）的丰度也增高。
图 2 KDY大鼠各肠段菌群丰度变化[（ $ \bar x $），n = 6]A：同龄大鼠门水平；B：同龄大鼠纲水平；C：同龄大鼠目水平；D：同龄大鼠科水平；E：同龄大鼠属水平（均数，n = 3）。WT：野生型SD大鼠；Uox-/-：KDY大鼠。其中1～18为小肠，19～20为结肠。Figure 2. Variation of flora abundance in each intestinal segment of KDY rats[（ $\bar x $），n = 6]在属水平统计细菌种类数，发现野生型SD大鼠的细菌种类数波动较大。与野生型SD大鼠相比，KDY大鼠各肠段菌群多样性总体上具有减少趋势，其中第9肠段的菌群种类明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05），见 图3。
图 3 KDY大鼠各节段菌群属水平多样性变化与野生型大鼠（WT）相比，KDY大鼠（Uox-/-）各节段菌群属水平多样性变化（$\bar x \pm s $ Figure 3. Variation of microflora at genus level in each segment of KDY rats2.3 大鼠粪便菌群变化
同龄KDY大鼠新鲜粪便微生物分布在门（图4A）、纲（图4B）、目（图4C）、科（图4D）和属（图4E）水平均有明显不同。与肠道菌群变化不同的是，KDY大鼠粪便中的微生物多样性呈现增加趋势。从属水平（图4E）看，与SD大鼠相比，KDY大鼠新鲜粪便克罗诺菌属（Cronobacter）丰度明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。乳杆菌属（Lactobacillus）丰度明显增加，这一点与各肠段的数据一致。
图 4 KDY大鼠新鲜粪便菌群丰度变化与野生型（WT）大鼠相比，KDY（Uox-/-）大鼠新鲜粪便菌群丰度变化（均数，n = 6）。A：大鼠新鲜粪便菌群丰度在门水平变化；B：大鼠新鲜粪便菌群丰度在纲水平变化；C：大鼠新鲜粪便菌群丰度在目水平变化；D：大鼠新鲜粪便菌群丰度在科水平变化；E：大鼠新鲜粪便菌群丰度在属水平变化。*P < 0.05 （双尾）。Figure 4. Abundance changes of fresh fecal flora in KDY rats与肠道内菌群不同的是，野生型SD大鼠和KDY大鼠粪便中的克罗诺杆菌属（Cronobacter，图4E）丰度均较乳酸杆菌增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。其所在的门（Proteobacteria，变形菌门， 图4A）纲（Gammaproteobacteria，γ-变形菌纲，图4B）目（Enterobacteriales，肠杆菌目，图4C）科（Enterobacteriaceae，肠杆菌科，图4D）的丰度也增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。
从物种多样性看，野生型SD大鼠与KDY大鼠新鲜粪便在门、纲、目、科和属水平上相比均无明显差异（P > 0.05），见 图5。
图 5 KDY大鼠新鲜粪便不同水平的种类差异与野生型大鼠（WT）相比，KDY大鼠（Uox-/-）新鲜粪便不同水平的种类差异（$\bar x \pm s $ Figure 5. Species differences of fresh feces in KDY rats at different levels2.4 乳酸杆菌属丰度变化
在属水平，不管是在野生型SD大鼠还是KDY大鼠，乳酸杆菌属（Lactobacillus）是各段肠中丰度最高的菌属。特别地，KDY大鼠各肠段乳酸杆菌均处于较高丰度水平，只有在结肠以及粪便中才锐减（可能与乳酸杆菌厌氧有关），但也较野生型SD大鼠高，差异有统计学意义（P < 0.05），见 图6。
图 6 乳酸杆菌属（Lactobacillus）在各段肠及粪便中的变化趋势乳酸杆菌属（Lactobacillus）在各段肠及粪便中的变化趋势［（$\bar x \pm s $ Figure 6. Change trend of lactobacillus in intestinal tract and feces3. 讨论
尿酸酶缺失KDY大鼠的成功研制为研究高尿酸血症、痛风及相关疾病提供了较理想的模型动物[7-12]。雄性KDY大鼠血尿酸水平远高于野生型SD大鼠，其血尿酸水平在50～80 μg/mL之间，与成年男性的血尿酸水平接近[4, 12]，但远低于文献报道的尿酸酶缺失小鼠[3]。该大鼠断奶后的1 a生存率达90%以上[4]，因此KDY大鼠可用于高尿酸血症、痛风及相关疾病的长期研究。
本研究发现尿酸酶缺失后，各肠段的菌群多样性有下降趋势，且小肠中段（第9段，相当于空肠和回肠交界处）菌群多样性下降具有统计学差异。不同的是，KDY大鼠新鲜粪便中的菌群多样性却基本一致，尽管某些菌群的丰度发生了较大改变。
尿液和粪便是尿酸排泄的两个主要途径，一般认为前者约占2/3，后者约占1/3。笔者用KDY大鼠证实，正常KDY大鼠的尿液尿酸排泄约占90%，粪便尿酸排泄约占10%[12]，这说明正常情况下肠道尿酸排泄的地位远低于肾脏。特别地，肠道菌群与血尿酸水平的关系尚不明确。考虑到很多细菌表达尿酸酶，寄生在肠道的细菌可能参与尿酸降解代谢，因此有人认为肠道菌群可能有利于血尿酸降低[5-6]。然而笔者前期用雄性KDY大鼠证明：KDY大鼠的新鲜粪便含有更多的细菌，且用抗菌药物抑制肠道细菌后血尿酸水平也未发生明显变化[13]，这似乎说明肠道菌群可能不是影响血尿酸的主要因素（高表达尿酸酶的基因工程菌除外）。
由于肠道中真菌的丰度极低，本研究只较系统地用16SrDNA测序技术研究了雄性KDY大鼠的各肠段的细菌变化。从整体上看，KDY大鼠各肠段菌属有减少的趋势，但乳酸菌属的丰度却总体上高于野生型SD大鼠。考虑到，大多数乳酸菌属于益生菌，该菌属的增加可能有利于维持KDY大鼠的肠道健康[14]，从而降低其他致病菌或条件致病菌如假单胞菌（Pseudomonas）、支原体（Mycoplasma）、棒状杆菌（Corynebacterium）、不动杆菌（Acinetobacter）、链球菌（Streptococcus）、草螺菌（Herbaspirillum）、梭菌（Clostridiales）、罗思氏菌属（Rothia）和螺旋杆菌（Helicobacter）的丰度，继而可能有助于对抗尿酸酶缺失后的肠道损伤[15]。且KDY大鼠肠液的尿酸水平远高于野生型SD大鼠[12, 15]，这种现象可能与高尿酸环境有利于乳酸菌属生存有关。
总之，与野生型SD大鼠相比，KDY大鼠肠道和粪便菌群发生了较大变化，在肠道菌群多样性有所减少的趋势下整体增加了乳酸菌的丰度。
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图 1 KDY大鼠的血尿酸水平和体重变化[（ $\bar x \pm s $），n = 6]
A：45 d龄大鼠血清尿酸水平；B：45 d龄大鼠体重（$\bar x \pm s $，n = 6）。WT：野生型SD大鼠；Uox-/-：KDY大鼠。*P < 0.05 （双尾）。
Figure 1. Changes of blood uric acid level and body weight in KDY rats[（ $\bar x \pm s $），n = 6]
图 2 KDY大鼠各肠段菌群丰度变化[（ $ \bar x $），n = 6]
A：同龄大鼠门水平；B：同龄大鼠纲水平；C：同龄大鼠目水平；D：同龄大鼠科水平；E：同龄大鼠属水平（均数，n = 3）。WT：野生型SD大鼠；Uox-/-：KDY大鼠。其中1～18为小肠，19～20为结肠。
Figure 2. Variation of flora abundance in each intestinal segment of KDY rats[（ $\bar x $），n = 6]
图 3 KDY大鼠各节段菌群属水平多样性变化
与野生型大鼠（WT）相比，KDY大鼠（Uox-/-）各节段菌群属水平多样性变化（$\bar x \pm s $，n = 3）。其中1～18为小肠，19～20为结肠。独立分组t检验，*P < 0.05 （双尾）。
Figure 3. Variation of microflora at genus level in each segment of KDY rats
图 4 KDY大鼠新鲜粪便菌群丰度变化
与野生型（WT）大鼠相比，KDY（Uox-/-）大鼠新鲜粪便菌群丰度变化（均数，n = 6）。A：大鼠新鲜粪便菌群丰度在门水平变化；B：大鼠新鲜粪便菌群丰度在纲水平变化；C：大鼠新鲜粪便菌群丰度在目水平变化；D：大鼠新鲜粪便菌群丰度在科水平变化；E：大鼠新鲜粪便菌群丰度在属水平变化。*P < 0.05 （双尾）。
Figure 4. Abundance changes of fresh fecal flora in KDY rats
图 5 KDY大鼠新鲜粪便不同水平的种类差异
与野生型大鼠（WT）相比，KDY大鼠（Uox-/-）新鲜粪便不同水平的种类差异（$\bar x \pm s $，n = 6）。
Figure 5. Species differences of fresh feces in KDY rats at different levels
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