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小鼠胚胎脑源与脊髓源神经干细胞增殖能力的比较

赵瑜 袁婧 刘建军 鲁琳

龚霞蓉, 边立功, 陈渝晖, 陈婧, 王波, 毕国力. 扩散峰度成像技术检测急性期癫痫大鼠模型的成像改变[J]. 昆明医科大学学报, 2021, 42(4): 28-32. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210405
引用本文: 赵瑜, 袁婧, 刘建军, 鲁琳. 小鼠胚胎脑源与脊髓源神经干细胞增殖能力的比较[J]. 昆明医科大学学报, 2017, 38(09): 19-23.
Xia-rong GONG, Li-gong BIAN, Yu-hui CHEN, Jing CHEN, Bo WANG, Guo-li BI. A Study on Diffusion Kurtosis Imaging in Acute Epilepsy Rats[J]. Journal of Kunming Medical University, 2021, 42(4): 28-32. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210405
Citation: Zhao Yu , Yuan Jing , Liu Jian Jun , Lu Lin . Comparison of Proliferation between Fetal Forebrain-and Spinal Cord-Derived Neural Stem Cells in Mice[J]. Journal of Kunming Medical University, 2017, 38(09): 19-23.

小鼠胚胎脑源与脊髓源神经干细胞增殖能力的比较

基金项目: 

基金: 云南省应用基础研究基金资助项目 (2014C039Y);

Comparison of Proliferation between Fetal Forebrain-and Spinal Cord-Derived Neural Stem Cells in Mice

Funds: 

基金: 云南省应用基础研究基金资助项目 (2014C039Y);

  • 摘要: 目的 探讨小鼠前脑源和脊髓源神经干细胞 (NSCs) 的增殖能力差异.方法 选择孕14 d C57BL胎鼠, 机械分离法从前脑和脊髓分离培养神经干细胞, Nestin/Sox2免疫荧光染色鉴定NSCs.计算细胞倍增速率 (Multiplication rate) 和细胞倍增时间 (Cell doubling time) , Brd U/Nestin双标检测NSCs增殖.结果 由C57BL胎鼠前脑和脊髓分离得到的细胞群, 均可在体外分裂增殖形成神经球, Nestin&Sox2标记阳性.脑源NSCs增殖速度显著高于脊髓源 (P<0.05) , 而倍增时间则与增殖能力成反比;P5代时两种干细胞增殖最快;Nestin&Brd U双标的NSCs也证明了正在增殖的脑源NSCs (29.65±3.38) %显著多于脊髓源的NSCs (19.93±1.95) % (P<0.05) .结论 来源于前脑的NSCs增殖能力更强.
  • 癫痫是神经系统常见慢性疾病之一,其反复发作可致患者记忆力、语言及执行力等认知功能损害,生活质量下降,给家庭和个人带来不利影响。癫痫发病率很高,据估计全世界约有7000万人患有癫痫[1],但其病因及发病机制仍不清楚。

    扩散峰度成像(diffusional kurtosis imaging,DKI)是扩散张量成像的延伸。它对微结构变化比扩散张量成像更敏感性[2-3]。在癫痫[4]、帕金森[5]、外伤[6]等疾病的应用中也证实了这一点。本研究拟采用扩散峰度成像对锂-匹罗卡品诱导癫痫急性期模型进行研究,探讨癫痫急性期的大鼠脑组织内部微观结构改变,进一步从分子影像学角度探讨癫痫急性期病理生理学改变。

    将体重180~250 g的雌性SD大鼠22只随机分为对照组(9只大鼠)和模型组(13只大鼠)。给模型组大鼠腹腔注射氯化锂,剂量为127 mg/kg。18~24 h后,以30 mg/kg的剂量注射毛果芸香碱。30 min后,如果没有IV级以上的发作,则每15 min注射1次10 mg/kg的额外剂量,直到出现IV级以上没有明显间歇的癫痫持续状态。癫痫后1 h,注射地西泮10 mg/kg终止发作。

    采用3.0T美国GE HDXT磁共振仪及专用大鼠线圈进行MR扫描。检查前通过腹膜内注射10 mL/kg的3.6%水合氯醛麻醉试验大鼠。获得常规MRI图像(T2WI)及DKI图像。其中DKI参数:重复时间/回波时间 = 6000/94.9 ms,视野 = 80 mm×40 mm,矩阵 = 96×96,层厚 = 2.4 mm,采集次数 = 4次。b值采用3个,分别为0,1000,2 000,扩散梯度方向:60个。

    采用SUN ADW4.4工作站Functool软件对扩散峰度图像进行后处理,以获得FA、MD、MK、K∥、K⊥图,见图1。由主治医师及副主任医师各1名一起阅片,测量并记录双侧梨状皮质,内嗅皮层和海马的ROI(如图所示长箭,为海马;短箭为梨状皮层及内嗅皮层)。因大鼠内嗅皮层及梨状皮层在3.0TMR不易区分,将这2个脑区一起考虑。ROI的形态与面积根据被测区的形态和大小而定,以尽量减小容积效应对各测量值的影响。

    图  1  DKI在急性癫痫大鼠脑组织的测量位置
    A:FA图;B:MD图;C:MK图;D:K∥图;E:K⊥图;F:T2WI。
    Figure  1.  Brain regions measured by DKI in acute epileptic rats

    测量数据以均数±标准差( $\bar x \pm s$)表示。采用SPSS 17.0统计学软件对模型组、对照组大鼠所测的DKI各指标值(FA、MD、MK、K∥、K⊥值)进行统计分析。数据服从正态分布。运用两独立样本成组t检验,比较模型组与对照组的双侧梨状皮层及内嗅皮层、海马的FA、MD、MK、K∥、K⊥值,P < 0.05为差异有统计学意义。

    与对照组相比,模型组大鼠双侧梨状皮层/内嗅皮层的MD降低,MK、K∥、K⊥升高,差异有统计学意义(P < 0.05),见 表1表2。与对照组相比,模型组大鼠双侧海马FA、MD、MK、K∥、K⊥差异无统计学意义(P > 0.05),见 表3表4

    表  1  对照组和模型组大鼠左侧梨状皮层/内嗅皮层的DKI值比较( $\bar x \pm s $)
    Table  1.  Comparisons of DKI values of the left piriform cortex/entorhinal cortex between control group and model group ( $\bar x\pm s $)
    DKI指标值 FA MD MK K∥ K⊥
    对照组 0.16 ± 0.03 1.62 ± 0.12 0.93 ± 0.07 0.81 ± 0.06 1.00 ± 0.09
    模型组 0.17 ± 0.03 1.21 ± 0.53 1.3 ± 0.44 1.11 ± 0.38 1.41 ± 0.48
    t −1.304 2.44 −2.73 −2.632 −2.773
    P 0.207 0.032* 0.020* 0.024* 0.019*
       *P < 0.05。
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    表  2  正常对照组和模型组大鼠右侧梨状皮层/内嗅皮层的DKI值比较( $ \bar x \pm s$)
    Table  2.  Comparisons of DKI values of the right piriform cortex/entorhinal cortex between control group and model group ( $\bar x \pm s $)
    DKI指标值 FA MD MK K∥ K⊥
    对照组 0.14 ± 0.02 1.69 ± 0.08 0.89 ± 0.04 0.78 ± 0.04 0.95 ± 0.05
    模型组 0.15 ± 0.02 1.27 ± 0.56 1.26 ± 0.46 1.09 ± 0.39 1.36 ± 0.5
    t −1.13 2.46 −2.668 −2.633 −2.685
    P 0.270 0.033* 0.023* 0.025* 0.023*
       *P < 0.05。
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    表  3  正常对照组和模型组大鼠左侧海马的DKI值比较( $\bar x \pm s $)
    Table  3.  Comparisons of DKI values of left hippocampus between normal control group and model group ( $\bar x \pm s $)
    DKI指标值 FA MD MK K∥ K⊥
    对照组 0.15 ± 0.04 1.62 ± 0.10 0.86 ± 0.23 0.80 ± 0.06 0.96 ± 0.1
    模型组 0.13 ± 0.02 1.60 ± 0.5 0.87 ± 0.04 0.76 ± 0.05 0.93 ± 0.04
    t 1.59 0.098 −0.216 1.557 0.98
    P 0.127 0.923 0.831 0.135 0.33
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    表  4  正常对照组和模型组大鼠右侧海马的DKI值比较( $\bar x \pm s $)
    Table  4.  Comparisons of DKI values of right hippocampus between control group and model group ( $\bar x\pm s $)
    DKI指标值 FA MD MK K∥ K⊥
    对照组 0.13 ± 0.02 1.65 ± 0.11 0.91 ± 0.07 0.77 ± 0.05 0.98 ± 0.08
    模型组 0.15 ± 0.03 1.56 ± 0.49 0.89 ± 0.05 0.76 ± 0.04 0.97 ± 0.06
    t −1.68 0.589 0.413 0.538 0.41
    P 0.115 0.563 0.684 0.596 0.68
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    癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病,它是神经元异常放电反复发作引起的短暂性中枢神经系统功能障碍,磁共振成像在其诊断中起重要作用。笔者以往的研究也证实常规MRI检查可以观察到急性期癫痫大鼠的脑组织改变[7]。扩散成像技术是唯一能活体内观察水分子扩散运动的成像技术,是磁共振功能成像技术的重要组成部分,与常规MR相比,它能够更好地显示组织改变。扩散加权成像、扩散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)及扩散峰度成像(diffusion kurtosis imaging,DKI)都属于扩散成像技术,其中扩散加权成像广泛应用于临床工作,扩散张量成像和扩散峰度成像主要用于研究中。

    扩散张量成像可以反映水分子扩散的各向异性。缺点是不能检测神经组织中的体素内复杂纤维束方向[8-9]。DKI是近几年来出现的一种成像方法,可以探查非高斯分布的水分子扩散能力,描述扩散偏离高斯行为的程度。它通过估计扩散和峰度张量,来量化生物组织中发生的受限的非高斯扩散[2,10]。与DTI相比,DKI具有更高的敏感性,能够解决DTI无法解决的纤维交叉问题[11]。DKI可以获得张量参数FA值、MD值,同时也可以获得峰度参数平均峰度(mean kurtosis,MK)、径向峰度(radial kurtosis,K⊥),平行峰度(axial kurtosis,K∥)。虽然MD 及 FA 值是DTI的参数,但基于DKI所获得的FA、MD的计算方法较 DWI、DTI 更复杂[12-13]。MK、K⊥、K∥是DKI主要的峰度参数,是反映神经系统病变早期微观改变的高度敏感指标[14]。平均峰度MK值是DKI最具代表的参数,反映分子扩散在各个方向上偏移高斯分布偏移量的平均值,可以反映组织微结构复杂程度。组织结构越复杂,非正态分布扩散受限越明显,MK值越大。K∥是峰度在扩散本征矢量中最大的扩散本征值,为沿神经纤维走行方向上的扩散峰度值。K⊥是主要扩散正交方向上峰度的平均值[15]。K⊥越大表明在正交方向上非正态分布扩散受限越明显。

    本研究中模型组双侧海马与正常对照组相比,其DKI各指标值的差异无统计学意义(P > 0.05)。提示与正常对照组相比,急性期癫痫大鼠双侧海马没有明显改变,相对于梨状皮层、内嗅皮层,海马病变出现较晚。这与陈建新等 [16-17]的研究结果类似,认为颞叶内侧癫痫的异常放电活动可起源于杏仁核,在早期海马可以没有明显改变。这与以往的多数研究认为的癫痫起源于海马的结果相悖,可能与本样本例数较少导致没有统计学差异有关,后续还需要增加病例数来进一步证实。

    此外,本研究中模型组大鼠双侧梨状皮层/内嗅皮层MD降低,FA值升高,提示急性期癫痫大鼠双侧梨状皮层及内嗅皮层的神经轴索均受损,髓鞘的完整性及纤维致密性下降,水分子扩散受限。而癫痫组双侧梨状皮层/内嗅皮层MK的升高提示模型组双侧梨状皮层、内嗅皮层的组织结构复杂程度增加,非高斯分布水分子扩散受限。这个结果也印证了MD值的变化。此外K∥、K⊥升高,进一步说明模型组双侧梨状皮层、内嗅皮层在垂直及平行于主要扩散方向非正态分布扩散受限显著。笔者认为造成上述结果的原因在于急性期双侧梨状皮层及内嗅皮层的神经元细胞发生细胞毒性水肿。急性期时由于谷氨酸兴奋性递质持续释放[18]及内嗅皮层、梨状皮层局部血流量降低和能量相对供应不足[14, 19]等原因的存在,使内嗅皮层、梨状皮层神经元细胞产生细胞毒性水肿,导致组织间隙变窄,水分子扩散受限,继而出现MD值降低。同时也是由于细胞毒性水肿的存在,使得组织微结构较正常时更为复杂,所以MK、K∥、K⊥升高。而本实验中癫痫组双侧梨状皮层/内嗅皮层的FA值虽然升高,但差异无统计学意义(P > 0.05),提示对于急性期模型而言,FA值没有MD、MK、K∥、K⊥敏感。

    总之,本研究说明DKI可以用于急性期癫痫模型的研究,可以发现癫痫急性期大鼠模型的微观组织学改变,从分子影像学角度反映癫痫急性期大鼠的脑组织微观结构改变。

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  • 收稿日期:  2017-04-19

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